Necrostatin-1对免疫检查点抑制剂相关心肌炎的改善作用及机制

摘要

目的 探讨Necrostatin-1(Nec-1)对免疫检查点抑制剂相关心肌炎（immune checkpoint inhibitor-associated myocarditis,ICIAM）小鼠模型病情的改善作用及潜在机制。方法 选择10只6～8周雄性BALB/c小鼠，建立ICIAM小鼠模型。采用超声心动图和血清心肌损伤标志物评估小鼠心功能。分别采用酶联免疫吸附试验（ELISA）和实时荧光定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）检测炎症标志物肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白细胞介素1β(IL-1β)水平。通过苏木精-伊红（HE）染色评估心肌组织炎症细胞浸润水平；通过Masson染色评估心肌纤维化程度。采用Western印迹法检测小鼠心肌坏死性凋亡相关蛋白，包括受体相互作用蛋白1(RIP1)、RIP3、混合谱系激酶结构域样蛋白（MLKL）及其磷酸化形式的表达。提取脾脏淋巴细胞，将其与HL-1细胞系共培养，采用CCK-8法检测细胞活力，观察HL-1细胞中线粒体活性氧（ROS）释放和线粒体膜电位变化，测定HL-1细胞内RIP1、RIP3、MLKL及其磷酸化形式表达。检测HL-1细胞中氧化应激标志物丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性。结果 Nec-1能改善ICI导致的小鼠心功能损害，减少ICIAM小鼠血浆中TNF-α和IL-1β的水平（P<0.001）；抑制磷酸化RIP1、RIP3和MLKL的表达（P<0.05）；降低MDA活性，提高SOD活性和GSH-Px活性（P<0.001）。HL-1细胞中，Nec-1干预能抑制RIP1-RIP3-MLKL通路激活（P<0.05）；改善由淋巴细胞诱导的HL-1细胞活力降低（P<0.001）；减少线粒体ROS释放，增加线粒体膜电位，降低MDA活性，提高SOD和GSH-Px活性（P<0.001）。结论 坏死性凋亡在ICIAM的发生发展中起重要作用，而Nec-1可通过抑制心肌细胞氧化应激减少坏死性凋亡，缓解ICIAM进展；RIP1可能为未来ICIAM治疗的新靶点。

关键词

免疫检查点抑制剂 / 心肌炎 / Necrostatin-1 / 氧化应激 / 坏死性凋亡

基金资助

国家自然科学基金（82170359,82470354）; 非传染性慢性病国家科技重大专项（2023ZD0502800）; 中国医学科学院中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金（2024-JKCS-28）; 上海市启明星培育（扬帆专项,24YF2744200）; 上海市申康医院发展中心市级医院诊疗技术项目（SHDC22023207）