miR-30b/USP14轴通过非PINK1/Parkin通路调控线粒体自噬在神经元氧糖剥夺/复氧损伤中的作用研究

摘要

目的 探讨微小RNA（microRNA, miR）-30b通过调控泛素特异性肽酶14（ubiquitin specific peptidase 14, USP14）影响非PTEN诱导激酶1（PTEN-induced kinase 1, PINK1）/Parkin通路依赖性线粒体自噬在神经元氧糖剥夺/复氧（oxygen-glucose deprivation/reoxygenation, OGD/R）损伤中的作用机制，为新生儿缺氧缺血性脑病的治疗提供新思路。方法 分离胎鼠皮层神经元并建立OGD/R模型。实验分为两部分：（1）将细胞随机分为对照组、OGD/R组、OGD/R+miR阴性对照（miR-NC）组、OGD/R+miR-30b模拟物（mimic）组、OGD/R+miR-30b mimic+过表达阴性对照组（oe-NC）组、OGD/R+miR-30b mimic+USP14过表达（oe-USP14）组；（2）另取细胞随机分为对照组、OGD/R组、OGD/R+miR-NC组、OGD/R+miR-30b mimic组、OGD/R+miR-30b mimic+siRNA阴性对照（si-NC）组、OGD/R+miR-30b mimic+siRNA敲降Parkin（si-Parkin）组、OGD/R+miR-30b mimic+siRNA敲降动力相关蛋白1（dynamin-related protein 1, Drp1）(si-Drp1)组。通过实时荧光定量PCR检测miR-30b、USP14 mRNA表达水平，CCK-8检测细胞活力，碘化丙啶（propidium iodide, PI）染色检测细胞死亡情况，Western blot法检测USP14、微管相关蛋白1轻链3（microtubule-associated protein 1 light chain 3, LC3）Ⅱ/LC3Ⅰ、线粒体外膜转位酶20（translocase of outer mitochondrial membrane 20, TOMM20）、PINK1、Parkin、Drp1蛋白表达水平，MitoTracker Green染色检测线粒体形态变化，MitoSOX Red荧光探针检测线粒体活性氧（reactive oxygen species, ROS）水平，AGO₂-RNA免疫共沉淀实验和双萤光素酶报告基因实验验证miR-30b与USP14的靶向结合关系。结果 与OGD/R组相比，OGD/R组+miR-30b mimic组细胞活力、miR-30b表达、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比例、Drp1蛋白表达升高（P<0.05）,PI阳性率、线粒体ROS水平、USP14 mRNA和蛋白表达、TOMM20蛋白表达、线粒体碎片化指数、线粒体体积降低（P<0.05）；两组PINK1、Parkin蛋白表达水平比较差异无统计学意义（P>0.05）。与OGD/R+miR-30b mimic+oe-NC组相比，OGD/R+miR-30b mimic+oe-USP14组细胞活力、miR-30b表达、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比例降低（P<0.05）,PI阳性率、线粒体ROS水平、USP14 mRNA和蛋白表达、TOMM20蛋白表达、线粒体碎片化指数、线粒体体积升高（P<0.05）。miR-30b可靶向调节USP14的表达。与OGD/R+miR-30b mimic+si-NC与OGD/R+miR-30b mimic+si-Parkin组LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比例、碎片化指数、线粒体平均体积比较差异无统计学意义（P>0.05）；与OGD/R+miR-30b mimic+si-NC组比较，OGD/R+miR-30b mimic+si-Drp1组LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比例降低，碎片化指数、线粒体平均体积升高（P<0.05）。结论 miR-30b通过靶向抑制USP14，独立于PINK1/Parkin通路调控线粒体自噬，对氧糖剥夺/复氧神经元损伤发挥保护作用。[中国当代儿科杂志，2025,27（12）:1526-1534]

关键词

缺氧缺血性脑病 / 线粒体自噬 / PINK1/Parkin通路 / 微小RNA-30b / 泛素特异性肽酶14 / 神经元