基于网络药理学与实验验证研究荜茇抗肺纤维化的作用机制

摘要

目的：通过网络药理学及分子对接技术初步预测荜茇抗肺纤维化的活性成分、作用靶点及信号通路，并通过体外实验进行初步验证荜茇抗肺纤维化的作用机制。方法：从TCMSP、Swiss Target Prediction和Pub Chem等数据库中获取药物的有效成分及对应靶点。使用Gene Cards和OMIM数据库收集疾病的相关靶点。利用jvenn在线工具筛选出药物与疾病的交集靶点，通过String数据库及Cytoscape3.9.1软件构建“药物-成分-靶点”与PPI网络图。使用微生信平台对交集靶点进行GO及KEGG富集分析，将富集KEGG前20条通路、核心靶点、药物成分，构建“成分-靶点-通路”网络并进行可视化。利用分子对接技术将药物成分与靶点进行对接，并对其部分对接结果可视化。培养HFL-1细胞，采用MTT法检测各浓度对细胞活力的影响，计算抑制率，从而筛选出最佳的药物浓度。将体外培养的HFL-1细胞分为4组，即对照组、TGF-β1组、TGF-β1+LD组（联合LD组）、TGF-β1+HD组（联合HD组）。采用CCK-8试剂检测24、48、72 h的细胞增殖活性。采用平板克隆形成实验来观察药物对HFL-1细胞克隆形成能力的影响。采用RT-qPCR和Western blot实验观察各组细胞α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、Ⅰ型胶原蛋白（COI-Ⅰ）、Ⅲ型胶原蛋白（COI-Ⅲ）的m RNA和PI3K-Akt信号通路蛋白表达水平。结果：共获得荜茇与抗肺纤维化交集靶点为197个。经拓扑学分析获得核心PPI网络，包含29个节点与199条边；GO功能分析显示，荜茇治疗肺纤维化（PF）生物学过程包括：凋亡过程负调控、信号转导、蛋白质磷酸化等。细胞成分包括：细胞质、核浆、等离子体膜。分子功能包括相同的蛋白结合、丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸激酶活性、蛋白结合等。KEGG信号通路被155条富集，而其中已被证实，与PF密切相关为PI3K-Akt信号通路，富集排名第四“。成分-靶点-通路”网络中PIK3CA、MAPK3、MAPK1、MTOR、SRC、CCND1、EGFR、PRKCA、BCL2、GSK3B链接度最高。荜茇宁、N-(2,5-二甲氧基苯基)-4-甲氧基苯甲酰胺、四氢丹参酮、豌豆素和胡椒碱是关键化合物。分子对接结果显示，除N-(2,5-二甲氧基苯基)-4-甲氧基苯甲酰胺外，其余化合物与10个链接度高的蛋白质结合活性较好。体外实验显示，48、72 h联合LD组增殖能力明显低于TGF-β1组（P<0.05）,24、48、72 h联合HD组又显著低于联合LD组。各药物组克隆数量显著减少（P<0.05）。联合LD和联合HD组α-SMA、COl-I、COl-Ⅲm RNA和蛋白表达水平明显低于TGF-β1组。与TGF-β1组相比，两个剂量组中p-PI3K/PI3K、pAKT/AKT蛋白表达显著减少（P<0.01）。结论：荜茇抗PF作用，其机制可能通过调控PI3K-Akt信号通路而发挥治疗PF作用。

关键词

荜茇 / 肺纤维化 / 网络药理学 / 分子对接 / HFL-1细胞 / PI3K-Akt信号通路