P物质及其受体Mas相关G蛋白偶联受体X2对肥大细胞激活昼夜节律的影响

摘要

目的：探讨P物质（substance P,SP）在肥大细胞昼夜节律性激活中的作用及其调控机制。方法：采用CCK-8比色法检测不同浓度SP对MCp815细胞活性的影响，确定后续实验的SP浓度。以免疫球蛋白E(immunoglobulin E,IgE)诱导建立MCp815细胞脱颗粒模型。设立空白对照组和BMAL1沉默组；采用656.1 nmol/L SP分别处理两组细胞30 min。在不同时间点检测肥大细胞（mast cell,MC）的激活情况。酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay, ELISA）检测组胺和类胰蛋白酶的释放水平。荧光定量PCR检测SP受体Mrgprx2、 Bmal1、 Per2的mRNA水平变化。通过染色质免疫沉淀和萤光素酶报告基因分析Mrgprx2基因中E-box中的DNA结合活性以及转录起始位点上游2.0 kb区域的启动子活性。C57BL/6小鼠随机分为对照组和SP组，每组10只。分别在LD10/10(10 h光/10 h暗)循环和非正常的LD12/12(12 h光/12 h暗)循环下饲养8周。采用HE染色检测小鼠鼻黏膜组织病理情况，Ly6G染色检测鼻黏膜组织髓系中性粒细胞和MC浸润；采用ELISA法检测组胺和类胰蛋白酶水平；qPCR检测小鼠鼻黏膜组织Tac1和Mrgprx2的mRNA水平变化。结果：（1）656.1 nmol/L SP对MC活性无显著影响（P>0.05）。在对照组中，SP处理12 h时，MC中组胺、类胰蛋白酶的分泌水平显著高于24 h时。在BMAL1沉默组中，各指标12 h和24 h时无显著差异。在60 h和72 h时，两组SP刺激MC前后产生的组胺和类胰蛋白酶水平均无显著差异。（2）用SP处理的野生型小鼠在ZT4时鼻腔内中性粒细胞浸润更为广泛，伴随组胺、类胰蛋白酶分泌的增加；而在ZT16时较少。（3）qPCR结果显示，在对照组中，SP处理后，骨髓源性肥大细胞（bone marrow-derived mast cells,BMMCs）在12h时Mrgprx2表达水平较24 h升高；但在BMAL1沉默的BMMCs中，这种差异消失。而在60 h和72 h时，两组细胞Mrgprx2表达没有统计学差异。在不同时相下，Mrgprx2表达水平同Per2水平变化趋势一致；与BMAL1水平变化趋势相反，并且与BMMCs释放的组胺和类胰蛋白酶的时相水平变化一致。（4）Mrgprx2基因中非经典E-box(CATGTGA)表现出明显的BMAL1结合活性，并展示出明显的时间效应。萤光素酶报告基因分析显示，BMAL1和CLOCK共同表达能使萤光素酶活性上调，而当E-box发生突变时，Mrgprx2无法转录。（5）置于LD10/10循环下饲养8周的小鼠中SP介导的中性粒细胞浸润和MC Tac1/Mrgprx2表达的节律性消失，而在正常LD12/12循环下饲养的小鼠中节律性表达仍存在。结论：SP可能在调节昼夜节律性MC激活中起着关键作用，潜在的作用机制可能是BMAL1/CLOCK通过直接结合SP受体Mrgprx2启动子区域的非经典E-Box位点调控Mrgprx2的转录。外周昼夜节律调控信号可能是变应性鼻炎中MC激活的重要途径。

关键词

P物质 / 过敏性鼻炎 / 肥大细胞激活 / 昼夜节律 / MRGPRX2

基金资助

国家自然科学基金项目（82474282,82174198,81774131）; 四川省科技厅2024年度省级科技项目（2024JDKP0125）