奶牛MCT4组织特异性表达及其与BHBA的分子互作

Tissue-specific Expression of MCT4 and Its Molecular Interaction with BHBA in Dairy Cows

摘要

探究荷斯坦奶牛单羧酸转运蛋白4（MCT4）的组织表达特性及其与酮病关键代谢物β-羟基丁酸（BHBA）的分子互作机制，为阐明MCT4在奶牛酮病发生与发展中的作用提供理论依据。采用多组学联用策略，首先，通过文献挖掘整合分析MCT4在奶牛各组织中的表达谱；然后，利用生物信息学工具对牛源MCT4蛋白进行序列比对、进化分析、结构域及理化性质预测；最后，通过同源建模和分子对接技术模拟MCT4与BHBA的结合模式。组织表达谱分析表明，MCT4在瘤胃、空肠、骨骼肌和乳腺等乳酸生成旺盛或能量需求高的组织中高表达。生物信息学分析显示，牛源MCT4蛋白由472个氨基酸组成，无信号肽，具有12个跨膜结构域，存在28个潜在磷酸化位点，其在进化上高度保守。分子对接结果表明，MCT4与活性形式（R）-BHBA可自发结合，结合自由能为-3.79 kcal/mol，其中Lys51残基与BHBA的羧基形成关键氢键（键长1.80 Å）。MCT4在奶牛代谢活跃组织中特异性高表达，其蛋白结构具备识别和结合BHBA的潜力。本研究从表达谱、蛋白结构及分子互作层面揭示了MCT4在酮体代谢中可能扮演的新角色，为以MCT4为靶点调控酮体转运、防治奶牛酮病提供了新的分子视角。

Abstract

This study aimed to investigate the tissue-specific expression pattern of monocarboxylate transporter 4 （MCT4） and its molecular interaction with β-hydroxybutyrate （BHBA）， a key ketone body metabolite， in Holstein dairy cows， to elucidate the role of MCT4 in the pathogenesis of ketosis. A multi-omics strategy was employed. First， the tissue expression profile of MCT4 was integrated through liteature mining. Second， bioinformatics tools were used for sequence alignment， phylogenetic analysis， and prediction of domains and physicochemical properties of bovine MCT4. Finally， the binding mode between MCT4 and BHBA was simulated using homology modeling and molecular docking techniques. The tissue expression profile analysis revealed that MCT4 was highly expressed in metabolically active tissues with high glycolytic flux or energy demand， such as the rumen， jejunum， skeletal muscle， and mammary gland. Bioinformatics analysis showed that bovine MCT4 consists of 472 amino acids， lacks a signal peptide， possesses 12 transmembrane domains， and has 28 potential phosphorylation sites， indicating high evolutionary conservation. Molecular docking results demonstrated that MCT4 can spontaneously bind to the active form （R）-BHBA with a binding free energy of -3.79 kcal/mol. A key hydrogen bond （length： 1.80 Å） was formed between the carboxyl group of BHBA and the Lys51 residue of MCT4. MCT4 is specifically highly expressed in metabolically active tissues of dairy cows， and its protein structure has the potential to recognize and bind BHBA. This study reveals， from the perspectives of expression profile， protein structure， and molecular interaction， the potential new role of MCT4 in ketone body metabolism， providing a novel molecular insight for targeting MCT4 to regulate ketone body transport and prevent ketosis in dairy cows.

Graphical abstract

关键词

单羧酸转运蛋白4（MCT4） / 奶牛 / 酮病 / β-羟基丁酸 / 组织表达 / 分子对接

Key words

Monocarboxylate transporter 4 （MCT4） / Dairy cow / Ketosis / β-hydroxybutyrate （BHBA） / Tissue expression / Molecular docking

膜转运蛋白是维持细胞生理功能的关键执行者，通过精确调控离子、代谢物和信号分子的跨膜转运，在维持细胞内外物质平衡与电化学梯度中发挥核心作用，对能量代谢、信号传递及内环境稳态至关重要。单羧酸转运蛋白（monocarboxylate transporters， MCTs）属于溶质转运蛋白家族16（solute carrier family 16，SLC16），目前已鉴定出14种亚型，包括MCT1（SLC16A1）、MCT2（SLC16A7）、MCT3（SLC16A8）、MCT4（SLC16A3）、MCT5（SLC16A4）、MCT6（SLC16A5）、MCT7（SLC16A6）、MCT8（SLC16A2）、MCT9（SLC16A9）、MCT10（SLC16A10）、MCT11（SLC16A11）、MCT12（SLC16A12）、MCT13（SLC16A13）和MCT14（SLC16A14） ^［1］。它们广泛表达于肝脏、肾脏及免疫细胞等多种组织中，通过质子偶联的运输机制，利用跨膜pH梯度产生的电化学势能驱动乳酸、酮体等单羧酸阴离子的定向转运，这一过程对维持细胞能量稳态尤为重要。其底物识别与转运效率受到底物结合区关键氨基酸残基的精密调控^［2-3］。

近年来，MCT4（由SLC16A3基因编码的单羧酸转运蛋白4）的研究取得显著进展，其功能远不止于乳酸转运，而是在多种病理生理过程中处于核心地位。MCT4以低乳酸亲和力（高K_m值）和高转运能力（高V_max值）为特征，在细胞内乳酸浓度较高时将其高效外排，防止乳酸积累导致的酸中毒^［4］。其在糖酵解活跃的细胞中高表达，并受HIF-1α、NF-κB和PKC等转录因子调控^［5-7］。研究表明，缺氧条件下HIF-1α可通过启动子中的缺氧反应元件（HRE）直接上调MCT4表达，增强乳酸外排以维持胞内pH稳定^［5］。在肿瘤中，MCT4与MCT1协同调控乳酸转运，影响肿瘤微环境的酸度和免疫应答^［8-9］——抑制MCT1可导致糖酵解型肿瘤细胞内乳酸堆积、pH失衡及细胞死亡，而MCT4通过持续外排乳酸维持肿瘤生长。针对MCT4的选择性hMCT4抑制剂bindarit已被开发，并显示出抗肿瘤潜力^［10］。此外，MCT4在神经系统小胶质细胞中的缺失会引起突触修剪异常和焦虑样行为^［11］。在非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）中，MCT4可能通过调控脂代谢关键基因减轻肝脏脂肪变性，发挥保护作用^［12］。在心脏疾病中，MCT4位于心肌细胞代谢轴的关键通路，其抑制可延缓心肌肥大进程^［13］。

乳酸与β-羟基丁酸（β-hydroxybutyrate， BHBA）虽均属单羧酸，但MCT4在BHBA转运中的作用尚未系统阐明。BHBA是体内三种酮体中含量最高的一种，另两种为乙酰乙酸（AcAc）和丙酮。酮体来源于肝脏脂肪酸β-氧化后的酮原生成，可作为脑、肌肉等重要组织在能量危机时的替代能源。然而，当酮体生成超过利用能力时，血液中BHBA水平异常升高（如奶牛>1.2 mmol/L），可引发酮病，这是一种以代谢性酸中毒为特征的常见代谢紊乱。酮病在高产奶牛泌乳早期发病率极高^［14］，临床型和亚临床型合计可影响超过50%的产后牛群，严重影响奶牛健康和生产性能^［15-16］。这意味着大多数奶牛在产后两周内出现外周血中BHBA浓度超过1.2 mmol/L的情况。奶牛外周血中高浓度BHBA的主要排除途径是通过尿液、乳汁或组织细胞的吸收和氧化代谢。然而，酮症奶牛的血酮恢复至正常水平需要相对较长的时间。在此过程中，组织细胞直接暴露于较高浓度的BHBA并受影响。这时MCTs对BHBA等酮体的转运尤为关键。

BHBA为小分子极性物质，含一个手性中心，存在R型（具代谢活性）和S型（无活性且可能抑制R型代谢）两种异构体^［17］。在哺乳动物中，R-BHBA由BDH1酶催化乙酰乙酸还原生成。酮病状态下，脂解增强导致BHBA积累，其转运高度依赖MCT蛋白家族：MCT1主要负责细胞对BHBA的摄取^［18-19］，而MCT4则主要介导乳酸外排，协同维持代谢稳态^［20-22］。研究表明，酮病奶牛外周血免疫细胞中MCT1表达上调以促进酮体利用，MCT4亦发生适应性变化，可能通过调节乳酸代谢参与炎症及能量平衡^［23］。此外，BHBA自身可反馈性地刺激瘤胃上皮细胞MCT4表达^［24］，提示其在转录层面存在调控机制。

目前，关于MCT4是否直接参与BHBA的转运以及其在酮病发生与发展中的具体作用机制，仍缺乏深入研究和系统阐释。因此，明确MCT4在BHBA跨膜转运中的功能，不仅有助于揭示奶牛酮病的分子机理，也将为开发以MCT4为靶点的新型调控策略提供理论依据，对改善奶牛健康、提升养殖效益具有重要应用价值。

1 材料与方法

1.1 奶牛不同组织中MCT4表达谱的生物信息学分析

通过美国国家生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information， NCBI）PubMed数据库，以“Dairy cattle monocarboxylate transporter 4”为关键词系统检索相关文献。文献筛选标准包括：①研究对象为健康荷斯坦奶牛（Bos taurus）；②采用PCR、Western blot、免疫组化或RNA-seq等技术检测MCT4蛋白或mRNA表达；③实验涵盖瘤胃、骨骼肌、乳腺等代谢相关组织；④动物样本及合理对照组；⑤提供体内组织表达数据（排除纯细胞培养或体外实验）。最终整合符合标准的文献数据，建立MCT4在奶牛各组织中的表达谱。

1.2 MCT4蛋白序列与结构生物信息学分析

自NCBI获取牛源SLC16A3（MCT4）蛋白序列，使用Expasy-ProtParam工具分析其理化性质。从UniProt数据库下载人、小鼠、大鼠、斑马鱼、鸡、马、牛等物种的MCT4氨基酸序列，通过DNAMAN 6.0软件进行序列比对，并采用MEGA 11.0软件以泊松校正法构建系统进化树（bootstrap=1 000次）。进一步通过生物信息学在线工具预测MCT4的信号肽、跨膜结构域、跨膜螺旋、磷酸化点位、二级结构/三级结构（表1）。

1.3 BHBA与MCT4的分子对接分析

1.3.1 配体与受体预处理

从PubChem数据库获取小分子配体（R）-β-羟基丁酸（BHBA，CID： 228）的3D结构，使用ChemDraw 21.0绘制分子结构，Chem3D 21.0中进行AM1半经验方法优化构象。在生理pH 7.4条件下对羧基进行去质子化处理（电荷为-1），并采用MOPAXC计算的ESP电荷进行验证。MCT4蛋白结构使用SPDBV_4.10软件及GROMOS96力场进行能量最小化处理，以消除局部不合理构象。

1.3.2 分子对接

使用AutoDock 4.0进行柔性对接，采用拉马克遗传算法（lamarckian genetic algorithm，LGA），设置50次独立运行，种群规模为300，最大能量评估次数为2.5×10⁶。通过 DoGSiteScorer软件预测MCT4蛋白活性口袋，选取最优口袋中第167、47、83、346、354、292、288、377位氨基酸残基为活性位点。设置对接网格盒尺寸为46.08×50.05×39.72 Å，网格点间距0.3972 Å，以涵盖关键结合区域。

1.3.3 结合模式分析

选取结合自由能最低且聚类分数最高的对接构象作为代表模型，通过PyMOL 3.1.4.1的“polar contacts”模块及PLIP在线工具（https：//plip-tool.biotec.tu-dresden.de/）分析BHBA与MCT4之间的氢键相互作用及键长，系统评估分子结合模式与稳定性。

2 结果与分析

2.1 奶牛MCT4组织表达谱分析

为系统探究MCT4在奶牛各类组织中的表达特征，本研究通过NCBI PubMed数据库检索相关文献，并依据预设标准（研究对象为健康荷斯坦奶牛，检测方法包括PCR、Western blot、免疫组化或RNA-seq等技术，覆盖主要代谢相关组织，提供体内表达数据等）进行严格筛选，最终纳入7篇高质量文献（表2）。发现在瘤胃、骨骼肌和乳腺中呈现显著高表达趋势，而在心脏和肾脏中表达水平相对较低。这一表达模式提示MCT4在乳酸生成较为旺盛或能量需求较高的组织中发挥关键作用，可能与泌乳期奶牛体内乳酸代谢和微环境酸碱平衡调节密切相关。

2.2 MCTs蛋白结构建模及其生物信息学分析

对奶牛MCT4蛋白（UniProt登录号：A0A3Q1N8C7）进行系统的生物信息学表征。该蛋白由472个氨基酸残基组成，分子量为50.65 kDa，分子式为C₂₃₃₁H₃₆₂₇N₅₈₃O₆₂₉S₂₄，原子总数为7194，理论等电点（pI）为6.88，带负电荷氨基酸残基（Asp+Glu）总数为34，带正电荷氨基酸残基（Arg+Lys）总数为34，表明其在生理条件下略带负电。不稳定系数为33.62（<40），提示该蛋白属于稳定蛋白；脂肪系数为104.75，为脂溶性蛋白；平均疏水性系数（GRAVY）为0.547，证实其整体具有明显的疏水特性，这与跨膜蛋白的典型性质一致。基于多物种MCT4氨基酸序列进行的进化分析显示，牛源MCT4与马MCT4亲缘关系最近，聚为一支，且脊椎动物间平均序列一致性达80.24%（图1和图2），说明该蛋白在进化过程中具有较高的保守性。

在结构特征方面，通过SignalP 4.1对奶牛MCT4蛋白的信号肽进行分析（图3），结果显示C值、Y值和S值的最大值分别为0.206、0.131和0.180，第1~35位氨基酸平均信号肽概率（S-mean）为0.092，最终D值为0.115，远低于阈值0.500，表明MCT4不存在信号肽序列，确认为非分泌型蛋白。使用Novopro进行跨膜结构预测（图4），结果显示MCT4具有12个跨膜螺旋结构。从胞内至胞外的螺旋区域包括：35~57、103~125、159~181、242~264、308~327和366~385。从胞外至胞内的螺旋区域包括：72~94、130~152、185~207、279~301、332~354和400~422，这一结构特征进一步支持其作为膜嵌入转运体的功能定位。使用NetPhos工具对磷酸化修饰位点进行预测（图5），共识别出28个潜在磷酸化位点，包括19个丝氨酸、7个苏氨酸和2个酪氨酸位点，提示MCT4可能受到复杂的翻译后调控，从而参与多种细胞信号转导通路。

在二级结构方面，通过SOPMA工具预测显示，MCT4蛋白中α-螺旋由194个氨基酸残基构成，占总数的41.10%；延伸链含84个残基，占比17.80%；无规则卷曲同样包含194个残基，占比41.10%；未预测到典型的β-折叠或β-转角结构（图6）。基于Kyte-Doolittle算法（ProtScale工具）疏水性分析表明，其最高疏水性出现在第339位半胱氨酸（Cys），分值为3.100；而最高亲水性区域位于第436位精氨酸（Arg）和437位组氨酸（His），分值均为-3.200（图7）。

进一步通过AlphaFold Server（v3.0）对奶牛MCT4蛋白进行三级结构预测，结果显示其三维构象以α-螺旋和无规则卷曲为主（图8），与二级结构预测高度一致。利用SPDBV_4.10对模型进行能量最小化优化后，采用PROCHECK模块（SAVES v6.1）通过Ramachandran图评估立体化学质量（图9），结果显示92.8%的残基位于最优区域［A， B， L］，7.2%位于允许区［a， b， l， p］，无残基处于异常构象区，全部残基均位于可接受区域，表明该三维模型构象合理、结构稳定可靠，适用于后续分子对接研究。

2.3 BHBA与MCT4分子对接

为深入探究β-羟基丁酸（BHBA）与MCT4之间的分子互作机制，本研究采用AutoDock 4.0对（R）-BHBA与MCT4蛋白进行了柔性分子对接分析（图10）。对接关键参数设置为：遗传算法运行50次，能量范围设为4 kcal/mol，并依据J.Chem.Inf.Model.2018标准将结合能低于-1.2 kcal/mol的复合物认定为有效对接。通过DoGSiteScorer软件预测MCT4蛋白的活性口袋（评分>0.8），最终选定第47、83、167、288、292、346、354和377位氨基酸残基作为潜在活性位点进行网格定义与对接计算。

结果显示，MCT4与（R）-BHBA的最低结合自由能为-6.26 kcal/mol，表明两者之间能够发生自发且稳定的结合。进一步借助PyMOL 3.1.4.1对结合自由能较低的复合物构象进行可视化分析，发现（R）-BHBA与MCT4蛋白第47位酪氨酸残基（Tyr-47）形成两条氢键，键长为4.0 Å、2.8 Å，同时也与第292位精氨酸残基（Arg292）形成一条盐桥，键长为3.1 Å。这一发现提示Tyr-47、Arg292很可能在MCT4识别和结合BHBA的过程中发挥关键作用，为从结构层面理解MCT4介导的单羧酸底物转运机制提供了重要依据。

3 讨论

单羧酸转运蛋白MCT4（由SLC16A3基因编码）是SLC16家族中负责乳酸外排的关键转运体，在奶牛能量代谢活跃的组织中具有高度特异性表达。本研究通过整合组织表达谱分析、生物信息学预测及分子对接模拟，系统揭示了奶牛MCT4在多种组织中的分布规律、蛋白结构特性及其与β-羟基丁酸（BHBA）的互作机制，为理解其在奶牛能量代谢与酮病发生中的作用提供了新的分子依据。

与既往研究相比，本研究发现MCT4在奶牛瘤胃、空肠、骨骼肌和乳腺中显著高表达，主要负责乳酸外排，与其在糖酵解活跃细胞中的功能定位一致。该结果与Wu等^［30］基于荷斯坦奶牛单细胞转录组的研究报道基本吻合，其发现SLC16A3在胃复层上皮各类细胞及髓系免疫细胞（如中性粒细胞、巨噬细胞）中广泛表达，提示MCT4在维持高糖酵解细胞的代谢稳态中发挥核心作用。值得注意的是，上述研究中检索SL16A3时发现，奶牛肝脏、唾液腺及外周血中只有免疫细胞表达MCT，表明其可能参与酮病状态下多组织的免疫反应，这一结果尚未见系统报道，拓展了MCT4在病理条件下的功能认知。

从蛋白结构特征来看，本研究预测的奶牛MCT4蛋白由472个氨基酸组成，分子量为50.65 kDa，理论等电点pI为6.88，属稳定疏水蛋白，无信号肽，具有12个典型跨膜螺旋，与人类及小鼠MCT4蛋白在关键结构域上高度保守。特别值得注意的是，NetPhos预测显示该蛋白存在28个潜在磷酸化位点（以丝氨酸为主），提示其功能可能受AMPK/PKA等激酶通路调控，从而在能量应激时发生快速适应性响应。此外，关键残基如Cys339和Arg436/His437可能在维持结构稳定性与质子耦合转运机制中发挥重要作用。

本研究最具讨论价值的结果在于通过分子对接揭示了MCT4与BHBA之间的结合模式。尽管传统上认为MCT4以乳酸为主要底物，本研究显示其与BHBA仍具有较好的结合能力，结合自由能为-6，26 kcal/mol，表明二者之间存在稳定结合。其中，关键相互作用包括Tyr-47与BHBA羧基形成的氢键（键长2.80 Å、4.0 Å），Arg292与MCT4形成一条盐桥（键长为3.1 Å）。这一结果提示MCT4在结构上具备识别并结合BHBA的潜力，为阐释酮病状态下MCT4可能参与酮体代谢转运提供了新的结构生物学依据。

4 结论

本研究从组织表达特征、蛋白结构属性及分子互作机制3个层面系统解析了奶牛MCT4的生物学特性，尤其揭示了其与BHBA的潜在结合能力与关键作用残基，不仅为理解MCT4在奶牛酮病发生中的代谢与免疫调节功能提供了新视角，也为今后针对该靶点开发酮病干预策略奠定了理论基础。

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基金资助

内蒙古自治区直属高校基本科研业务费项目(BR230132)

内蒙古自治区自然科学博士基金项目(2019BS03004)

内蒙古农业大学高层次人才科研启动项目(NDYB2018-22)

内蒙古农业大学生命科学学院青年基金项目(QN202101)

国家乳业技术创新中心开放课题项目(2024-KFKT-032)

内蒙古自治区高等学校创新团队项目(NMGIRT2219)