靶向抗TIGIT和PVRIG双特异抗体的制备及体外生物性活性的研究

摘要

目的 制备靶向抗T细胞免疫球蛋白-ITIM结构域蛋白（T cell immune receptor with Ig and ITIM domains, TIGIT）和脊髓灰质炎病毒受体相关免疫球蛋白结构域蛋白（Poliovirus receptor-related immunoglobin domain-containing protein, PVRIG）双特异抗体，探究其体外生物学活性。方法 用PVRIG人源化抗体hP1和TIGIT人源化抗体hT1构建KY-TIGIT-hlgG4M-PVRIG-SCFV双特异性抗体，将纯化得到KY-TIGIT-hlgG4M-PVRIG-SCFV抗体进行SDS-PAGE凝胶电泳、热稳定性检测和稳定性分析；采用流式细胞术（Fluorescence activated cell sorting, FACS）检测双特异性抗体的结合活性；采用生物干涉膜技术（Bio-layer interferometry, BLI）检测双特异性抗体亲和力；用Jurkat-NFAT-Luc2-PD1-TIGIT-PVRIG细胞和293T-OS8-PVRL2-PDL1细胞中检测双特异性抗体KY-TIGIT-hlgG4M-PVRIG-SCFV对于TIGIT/PVRIG靶点的阻断作用；采用CMV recall assay法检测IFN-r在上清液中的浓度。结果 SDS-PAGE凝胶电泳结果显示KY-TIGIT-hlgG4M-PVRIG-SCFV双特异性抗体纯度>95%;Tm结果为Tm1:66.34,Tm2:80.95。采用SEC-HPLC对双特异性抗体KY-TIGIT-hlgG4M-PVRIG-SCFV进行稳定性分析，其纯度均>90%。KY-TIGIT-hlgG4M-PVRIG-SCFV抗体和PVRIG的人源化抗体hP1与293T-PVRIG cell line的EC₅₀分别为0.168 70μg/mL和0.038 65μg/mL,与293T-cyno-PVRIG cell line的EC₅₀分别为0.037 14μg/mL和0.031 98μg/mL,与Human PVRIG Protein, His Tag的亲和力为1.74E-10M和1.69E-10M。KY-TIGIT-hlgG4M-PVRIG-SCFV抗体和TIGIT的人源化抗体hT1与293T-PVRIG cell line的EC₅₀分别为0.070 27μg/mL和0.031 21μg/mL;与293T-cyno-TIGIT cell line的EC₅₀分别为0.020 28μg/mL和0.028 22μg/mL;与Human TIGIT Protein, His Tag的亲和力为8.50E-10M和8.47E-10M。KY-TIGIT-hlgG4M-PVRIG-SCFV抗体具有阻断PD1/PDL1/TIGIT/PVRIG相互作用活性，且KY-TIGIT-hlgG4M-PVRIG-SCFV的EC₅₀为0.007μg/mL,优于单独人源化抗体hT1(EC₅₀为0.013μg/mL)和hP1(EC₅₀为0.048μg/mL)的作用。在含pp65 peptide条件下KY-TIGIT-hlgG4M-PVRIG-SCFV抗体分泌IFN-r为349.72 pg/mL,明显高于其他抗体。结论 KY-TIGIT-hlgG4M-PVRIG-SCFV抗体具有高亲和力和良好的生物学活性，有望开发成为肿瘤免疫治疗的抗体药物。

关键词

T细胞免疫球蛋白和ITIM结构域蛋白 / 脊髓灰质炎病毒受体相关免疫球蛋白结构域蛋白 / 人源化抗体 / 双特异性抗体 / 生物学活性