p62体募集自噬相关蛋白WIPI2的机制研究

摘要

目的 探讨自噬接头蛋白(Sequestosome 1,SQSTM1/p62)与磷脂酰肌醇3-激酶(Phosphatidylinositide 3-kinase, PI3K)复合物的结合蛋白WD重复结构域磷酸肌醇互作蛋白2(WD repeat domain phosphoinositide-interacting protein 2,WIPI2)在空间上定位的调控关系。方法 使用CRISPR-Cas9技术敲除正常大鼠肾上皮细胞(Normal rat kidney, NRK)中的自噬相关基因2A(Autophagy-related gene,Atg2A)、自噬相关基因2B(Autophagy-related gene,Atg2B)和p62基因，建立Atg2A和Atg2B基因敲除的细胞系(Atg2AB double knockout,Atg2AB DKO)以及p62基因敲除细胞系(p62 knockout,p62 KO);透射电镜观察Atg2AB DKO细胞中p62体周围囊泡的定位；活细胞成像观察Atg2AB DKO细胞内p62体与自噬相关蛋白WIPI2的定位变化；光漂白实验观察相变蛋白p62与WIPI2的荧光漂白恢复；通过免疫荧光观察WT、p62 KO和Atg2AB DKO细胞中WIPI2与p62的定位关系；通过蛋白免疫印记检测WT和p62 KO细胞中WIPI2表达量的变化。结果 建立了Atg2AB DKO和p62 KO细胞系；透射电镜显示Atg2AB DKO细胞中p62附近聚集了大量囊泡；在Atg2AB DKO中，通过活细胞成像观察到tdTomato-p62与WIPI2-GFP高度共定位；荧光漂白实验观察到WIPI2具有流动性；通过免疫荧光观察到，与WT细胞相比，在Atg2AB DKO中WIPI2点的数量明显增多(P<0.000 1);与WT细胞相比，p62 KO细胞中WIPI2点的数量和表达量无明显变化(P>0.05)。结论 无膜细胞器p62能够与具有流动性的WIPI2阳性囊泡动态融合，促进自噬体的形成。

关键词

自噬体 / 自噬接头蛋白 / WD重复结构域磷酸肌醇互作蛋白2