宫颈癌源外泌体miR-191-5p通过靶向TJP1调控血管内皮细胞层通透性促癌细胞转移的分子机制研究

摘要

目的 探讨宫颈癌细胞分泌的外泌体miR-191-5p对血管内皮细胞层的通透性影响，为肿瘤血管相关的基因靶点研究提供理论依据。方法 提取并鉴定宫颈癌细胞(SiHa/HeLa)培养上清来源的外泌体。将宫颈癌细胞源外泌体与人脐静脉内皮细胞(HUVEC)共培养，检测外泌体的摄取。跨内皮电阻(TEER)测定HUVEC单层细胞形成时间。内皮细胞层通透性测定HUVEC细胞层通透性。qRT-PCR检测宫颈癌细胞、外泌体及与外泌体共培养48 h的HUVEC中miR-191-5p表达。双荧光素酶报告基因实验检测miR-191-5p与TJP1的靶向关系。qRT-PCR、Western blot检测miR-191-5p、TJP1表达。内皮细胞层穿透实验检测miR-191-5p对HUVEC细胞层通透性的影响以及能否促进宫颈癌转移。恢复实验、qRT-PCR、Western blot检测TJP1的表达。结果 提取的微小囊泡确是宫颈癌源外泌体。宫颈癌源外泌体可被HUVEC细胞摄取。TEER随时间增加而增大，在培养3 d时细胞形成单层，TEER达到最大值；外泌体共培养的HUVEC细胞层通透性增大，差异有统计学意义(P<0.000 1)。miR-191-5p在宫颈癌源外泌体中富集，并被转运至HUVEC细胞中，miR-191-5p与TJP1存在靶向关系。与PBS组比较，miR-191-5p mimics组的miR-191-5p相对表达水平升高，TJP1的相对表达水平下降，而miR-191-5p inhibitor组的miR-191-5p相对表达水平下降，TJP1的相对表达水平升高，差异有统计学意义(P<0.01);与PBS组比较，miR-191-5p mimics组通透性增加，而miR-191-5p inhibitor组通透性减弱，差异有统计学意义(P<0.000 1)。在SiHa细胞中，与PBS组比较，miR-191-5p mimics组穿透的平均细胞数增加，miR-191-5p inhibitor组穿透的平均细胞数下降，差异有统计学意义(P<0.05)。在HeLa细胞中，与PBS组比较，miR-191-5p mimics组穿透的平均细胞数增加，miR-191-5p inhibitor组穿透的平均细胞数下降，差异有统计学意义(P<0.05)。恢复实验结果显示，与PBS组比较，miR-191-5p mimics组TJP1的相对表达量下降，差异有统计学意义(P<0.05);与miR-191-5p mimics组比较，pCMV-T+mimics组中TJP1的表达量增加，差异有统计学意义(P<0.01)。结论 宫颈癌源外泌体miR-191-5p通过靶向调控TJP1导致血管内皮细胞层通透性增加，进而促进宫颈癌细胞转移。

关键词

宫颈癌 / 外泌体 / miR-191-5p / 内皮细胞层通透性 / TJP1