基于CRISPR/Cas9技术PCSK9基因敲除小鼠模型的构建及表型验证

摘要

目的 基于CRISPR/Cas9技术构建前枯草杆菌蛋白原转换酶9(Preprotein convertase subtilisin/kexin type9,PCSK9)基因敲除小鼠模型并对其表型进行初步验证。方法 利用非同源末端连接(NHEJ)修复引入突变的方式，针对PCSK9基因靶序列设计单链向导RNA(sgRNA),将sgRNA和Cas9 mRNA显微注射到C57BL/6J小鼠受精卵，获得F0代敲除小鼠，通过繁育及基因型鉴定获得PCSK9基因敲除(PCSK9 KO)纯合子小鼠。采用PCR方法对PCSK9 KO小鼠进行基因鉴定，Western Blot检测肝组织PCSK9及低密度脂蛋白受体(LDL-R)蛋白的表达，同时检测心、脑、肾、脂肪组织中的PCSK9蛋白表达水平，q-PCR检测PCSK9的mRNA表达水平。采用酶法检测血清中总胆固醇(TC)及甘油三酯(TG)水平。结果 PCR产物凝胶电泳以及PCSK9蛋白及mRNA表达结果表明成功获得全身性PCSK9基因敲除小鼠，肝组织LDL-R(3.42±0.56)蛋白表达显著增高。与WT组相比，PCSK9小鼠血清TC(90.75±17.81 mg/dL vs 54.19±2.42 mg/dL)、TG(81.26±11.98 mg/dL vs 50.92±11.93 mg/dL)显著降低(P<0.001)。结论 基于CRISPR/Cas9技术成功构建获得PCSK9基因敲除小鼠，敲除PCSK9基因通过上调肝脏LDL-R蛋白显著降低血脂水平。

关键词

CRISPR/Cas9 / PCSK9 / 基因敲除 / 基因型鉴定 / 血脂水平

基金资助

新疆维吾尔自治区自然科学基金青年基金项目(2017D01C346)