抗原85B抑制自噬促进霍奇金淋巴瘤小鼠肿瘤凋亡机制研究

摘要

目的 研究抗原85B（Antigen 85B,Ag85B）对霍奇金淋巴瘤（Hodgkin lymphoma, HL）小鼠肿瘤生长、凋亡的作用及机制。方法 取HDLM-2细胞，用杜氏改良鹰培养基（Dulbecco′s modified eagle medium, DMEM）调整细胞密度为5×10～6个/200μL备用。取40只小鼠随机分为4组，小鼠左侧腋下酒精棉片擦拭消毒后给予接种相应试剂。Ⅰ组：接种DMEM基础培养基（200μL）;Ⅱ组：接种Ag85B（每克小鼠接种4μg Ag85B,用DMEM基础培养基调整总液量为200μL）;Ⅲ组：接种HDLM-2（5×10～6个/200μL）;Ⅳ组：接种HDLM-2（5×10～6个/200μL）+Ag85B;（每克小鼠接种4μg Ag85B,直接混入HDLM-2细胞，维持总液量为200μL）。每日接种一次，连续接种3日。期间每日观察各组小鼠活动、精神状况，毛发和饮食饮水情况。实验第7天、第14天、第21天、第28天、第35天小鼠称重并测量肿瘤的长径及短径，肿瘤体积达到1 000 mm³说明建模成功。第35天处死小鼠，剥离瘤体称重，测量肿瘤体积，计算抑瘤率。苏木精-伊红染色（Hematoxylin and Eosin, HE）比较I组、II组小鼠心、肝、脾、肺、肾组织结构。取Ⅲ组、Ⅳ组小鼠肿瘤组织进行后续检测比较，免疫组织化学（Immunohistochemistry, IHC）检测LC3、p62、Beclin-1、Caspase-3、Ki-67在肿瘤组织的定位及蛋白表达；免疫荧光检测Ki-67表达；TUNEL染色检测凋亡；透射电镜（Transmission electron microscopy, TEM）检测自噬体数量；实时荧光定量聚合酶链式反应法（Quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR）、蛋白质印迹法（Western blot）分别检测LC3、p62、Beclin-1、PI3K、AKT、mTOR mRNA和蛋白表达。结果 各组小鼠体重随时间延长有下降趋势，各组间比较差异无统计学意义（P>0.05）。Ⅰ组、Ⅱ组小鼠毛发有光泽，精神尚可，活动正常，未见肿瘤生长。Ⅲ组、Ⅳ组小鼠精神萎靡、活动减少、毛发无光泽，有肿瘤生长。与Ⅲ组比较，Ⅳ组小鼠肿瘤体积较小，差异有统计学意义（P<0.05）,Ag85B对肿瘤抑制率为20.53%。HE染色显示I组、II组小鼠心、肝、脾、肺、肾组织结构和细胞形态无明显差异。与Ⅲ组比较，Ⅳ组小鼠LC3、Beclin-1、Ki-67抗原表达减低，p62、Caspase-3表达增强，差异有统计学意义（P<0.05）;与Ⅲ组比较，Ⅳ组小鼠肿瘤Ki-67表达减低，差异有统计学意义（P<0.05）;与Ⅲ组比较，Ⅳ组小鼠肿瘤凋亡增强，差异有统计学意义（P<0.05）;与Ⅲ组比较，Ⅳ组小鼠肿瘤自噬体减少；与Ⅲ组比较，Ⅳ组小鼠肿瘤组织LC3、Beclin-1 mRNA及蛋白表达降低，p62、PI3K、AKT、mTOR mRNA及蛋白表达增高，差异有统计学意义（P<0.05）。结论 Ag85B可以抑制HL小鼠的肿瘤增长及增殖，促进肿瘤细胞凋亡，其机制与促进PI3K/AKT/mTOR通路、抑制自噬相关。

关键词

霍奇金淋巴瘤 / 抗原85B / 自噬 / 凋亡 / 增殖