ATG16复合体不同亚基对复合物结构稳定性及功能的调控研究

摘要

目的 探讨ATG12-ATG5-ATG16L1复合体中各亚基的缺失对复合物结构稳定性及功能的影响。方法 利用CRISPR-Cas9技术，在正常大鼠肾上皮细胞(Normal rat kidney, NRK)中建立Atg5、Atg12和Atg16L1敲除(Knockout, KO)细胞系；蛋白免疫印迹技术检测ATG12-ATG5-ATG16L1复合物中各亚基的缺失对其它亚基蛋白表达量的变化；免疫荧光实验观察ATG12-ATG5-ATG16L1复合物中各亚基的缺失对其它亚基的定位及对自噬体形成的影响。结果 成功建立Atg5 KO、Atg12KO、Atg16L1 KO细胞系；蛋白免疫印迹结果显示，与野生型(Wild type, WT)细胞饥饿4 h组相比，Atg5 KO细胞中，ATG12(P<0.01)与ATG16L1(P<0.000 1)表达量均降低；Atg12 KO细胞中，ATG16L1(P<0.001)表达量降低，ATG5(P<0.05)表达量升高；Atg16L1 KO细胞中，ATG5(P<0.01)表达量降低，ATG12(P>0.05)表达量无明显变化；免疫荧光实验结果显示，与WT细胞正常培养组相比，Atg5 KO细胞中ATG12(P<0.000 1)与ATG16L1(P<0.001)均不成点且胞质内呈弥散分布；Atg16L1 KO细胞中ATG5与ATG12均不成点且胞质内呈弥散分布(P<0.000 1);Atg12 KO细胞中，ATG5(P<0.000 1)与ATG16L1(P<0.001)成点数量均增多；Atg5 KO、Atg12 KO和Atg16L1 KO细胞中LC3(P<0.000 1)均不成点且在胞质中呈弥散分布。结论 ATG16复合体中不同亚基的缺失均会影响其它亚基蛋白表达量及定位的改变，各亚基的缺失导致ATG16复合体组装受阻使ATG16复合体功能异常，影响正常自噬体的形成。

关键词

自噬体 / 自噬相关蛋白12 / 自噬相关蛋白5 / 自噬相关蛋白16样1