基于网络药理学和动物实验探究陈元膏治疗膝骨性关节炎的作用机制

摘要

目的 利用网络药理学方法和动物实验探讨陈元膏治疗膝骨性关节炎(Kneeosteoarthritis, KOA)的作用机制，为陈元膏的临床应用提供科学依据。方法 通过TCMSP和HERB数据库筛选，确定陈元膏中的有效成分；经CTD、Swiss target prediction数据库获得陈元膏作用靶点；运用Genecards数据库获取KOA作用靶点；通过Venny2.1.0平台对陈元膏作用靶点和KOA作用靶点取交集并绘制韦恩图；通过Cytoscape3.10.0软件构建“中药-成分-靶点-疾病”可视化网络图；通过STRING及Cytoscape3.10.0软件构建蛋白质-蛋白质互作(Protein-protein interaction, PPI)网络图和核心靶点拓扑分析；将交集靶点导入METASCAPE数据库进行基因本体(Geneontology, GO)功能富集分析及京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG)通路富集分析；经分子对接验证陈元膏主要活性成分与核心靶点的结合情况。选取18只SPF级SD雄性大鼠为研究对象，随机抽取6只为空白组，其余12只采用木瓜蛋白酶建立KOA模型并通过奎森功能障碍指数(Lequesne functional severity index, Lequesne MG)评分进行模型验证。造模成功后，随机分为模型组，陈元膏组，各组6只。空白组和模型组不予干预，陈元膏组在膝关节周边区域均匀涂抹陈元膏进行治疗。干预28 d后，采用酶联免疫吸附试验(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)检测大鼠血清中磷脂酰肌醇3-激酶调节亚基1(Phosphoinositide-3-kinase regulatory subunit 1,PIK3R1)、蛋白激酶B(Protein kinase B alpha, AKT1),核因子κB亚基p65(Nuclear factor kappa B subunit p65,RELA)水平，通过苏木精-伊红(Hematoxylin and eosin, HE)染色观察大鼠膝关节软骨及滑膜组织病理形态变化。结果 经数据库筛选获得陈元膏有效活性成分20个、有效成分作用靶点762个；获得KOA作用靶点1 500个，陈元膏治疗KOA交集靶点197个；“药物-成分-靶点-疾病”获得秋水仙碱、别欧前胡素、脱氧穿心莲内酯等前3个主要活性成分；PPI网络分析得到PIK3R1、AKT1、RELA前3个核心靶点；GO功能富集分析表明陈元膏主要参与运动的正向调节，炎症反应，细胞对氮化合物的反应等生物过程。KEGG通路分析结果显示，陈元膏主要通过脂质与动脉粥样硬化信号通路，AGE-RAGE信号通路，JAK-STAT信号通路等发挥治疗KOA的作用。分子对接结果表明秋水仙碱，别欧前胡素等分别与PIK3R1,AKT1具有较强的结合力。动物实验结果显示，干预前1 d,与空白组相比，模型组和陈元膏组大鼠膝关节Lequesne MG评分升高(P<0.05);干预后28 d,与空白组比较，模型组大鼠Lequesne MG评分、曼金(Mankin osteoarthritis histological grading system, Mankin′s)评分升高，软骨表面凹凸不平、软骨细胞排列紊乱，滑膜结构显著异常、出现大量炎细胞浸润，血清中PIK3R1水平显著降低，AKT1、RELA水平显著升高，差异均有统计学意义(P<0.05);与模型组比较，陈元膏组大鼠Lequesne MG评分、Mankin′s评分降低，软骨表面较为光滑，滑膜结构趋于正常、炎细胞浸润程度减轻，血清中PIK3R1水平显著升高，AKT1、RELA水平显著降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 陈元膏主要通过脂质与动脉粥样硬化、AGE-RAGE、JAK-STAT信号通路，作用于PIK3R1、AKT1、RELA等靶点，参与运动的正向调节和炎症反应等生物过程，对KOA发挥治疗作用。

关键词

陈元膏 / 膝骨性关节炎 / 网络药理学 / 分子对接 / 动物实验