RAB29通过影响p62表达和定位参与自噬过程

摘要

目的 探讨Ras相关蛋白Rab-7L1(Ras-related protein Rab-7L1,RAB29)与自噬接头蛋白(Sequestosome1,SQSTM1/p62)之间的调控关系。方法 利用免疫荧光技术观察RAB29与高尔基体基质蛋白130(Golgi Matrix Protein 130,GM130)在正常大鼠肾上皮细胞(Normal rat kidney, NRK)中的共定位关系；采用活细胞成像技术观察樱桃荧光蛋白(monmer-Cherry Fluorescent Protein, mCherry)标记的RAB29与水疱性口炎病毒G蛋白-绿色荧光蛋白(Vesicular stomatitis virus G protein-green fluorescent protein, VSVG-GFP)的动态定位；利用CRISPR-Cas9基因编辑技术，在NRK细胞中分别敲除Rab29和富含亮氨酸的重复序列丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶2(Leucine-rich repeat Serine/Threonine-protein, LRRK2)基因，构建相应的基因敲除细胞系(Rab29 knockout,Rab29 KO;Lrrk2 knockout,Lrrk2 KO);通过蛋白免疫印迹检测野生型(Wild type, WT)、Rab29 KO和Lrrk2 KO细胞中p62、RAB29和LRRK2蛋白表达量的变化；免疫荧光观察WT、Rab29 KO和Lrrk2 KO细胞中p62成点数量的变化。结果 RAB29与GM130在NRK细胞中存在共定位；活细胞成像结果显示，RAB29-mCherry与VSVG-GFP存在动态共定位，且会随时间推移由高尔基体向细胞膜方向运输；成功建立Rab29 KO和Lrrk2 KO细胞系。蛋白免疫印迹和免疫荧光结果显示，与WT细胞相比，Rab29 KO细胞对照组(Control treatment, CT)和饥饿处理4 h组(4 hours starvation, Sta4 h)p62和LRRK2蛋白表达均上调(P<0.05),p62成点数量增加(P<0.05);Lrrk2 KO细胞仅CT组p62蛋白表达(P<0.01)及成点数量(P<0.001)增加，Sta4 h组中p62蛋白表达水平无变化(P>0.05),但成点数量增加(P<0.05),Lrrk2敲除对RAB29蛋白表达均无影响(P>0.05)。结论 定位于高尔基体的RAB29,可由高尔基体向细胞膜方向运输，通过影响p62蛋白的表达和定位参与自噬的调控。

关键词

Ras相关蛋白Rab-7L1 / 自噬 / 富含亮氨酸的重复序列丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶2 / 自噬接头蛋白