基于网络药理学探究新疆肉苁蓉乙醇提取物对伤口愈合的作用机制

摘要

目的 通过网络药理学、分子对接技术揭示新疆肉苁蓉乙醇提取物对伤口愈合的作用机制，并进行体内实验验证。方法 借助中药系统药理学(Traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform, TCMSP)数据库筛选新疆肉苁蓉有效成分，通过Swiss Target Prediction数据库预测其作用靶点；利用基因卡片(GeneCards)、治疗靶点(Therapeutic Target Database, TTD)、在线人类孟德尔遗传(Online mendelian inheritance in man, OMIM)数据库获取血管生成相关靶点，经Venny 2.1平台取交集确定共同靶点并绘制韦恩图；运用Cytoscape 3.7.2软件构建“药物-成分-靶点”可视化网络图，通过String数据库构建蛋白质-蛋白质互作(Protein-protein interaction, PPI)网络图；将共同靶点导入Metascape数据库进行基因本体(Gene ontology, GO)功能及京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG)通路富集分析；采用AutoDock Vinas(V.1.5.6)软件进行分子对接，验证有效成分与核心靶点的结合活性。选取24只10周龄雄性SPF-SD大鼠，随机选取18只建立皮肤创伤模型，造模成功后，随机分为模型对照组、肉苁蓉低剂量组(10μg/mL)、肉苁蓉高剂量组(100μg/mL),其余6只为空白对照组。模型对照组以生理盐水清洁创面，肉苁蓉低、高剂量组外敷相应浓度肉苁蓉乙醇提取物，持续干预14 d。采用免疫组化染色观察皮肤组织I型胶原蛋白(Collagen type I,COL1A1)、III型胶原蛋白(Collagen type III,COL1A3)、白细胞介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)、白细胞介素-6(Interleukin-6,IL-6)的表达；计算创面愈合率；采用酶联免疫吸附试验法检测血清IL-6、IL-1β、肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)、基质金属蛋白酶-9(Matrix metalloproteinase-9,MMP-9)的水平；通过逆转录实时定量聚合酶链反应法检测皮肤组织中TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA的水平；运用蛋白质印迹法检测皮肤组织磷酸化磷脂酰肌醇3-激酶(Phosphorylated phosphoinositide 3-kinase, P-PI3K)、磷酸化蛋白激酶B(Phosphorylated protein kinase B,P-AKT)及血管内皮生长因子A(Vascular endothelial growth factor A,VEGFA)、分化簇31(Cluster of differentiation 31,CD31)的表达。结果 通过数据库筛选得到新疆肉苁蓉有效成分6个，有效成分作用靶点170个，血管生成相关靶点2 393个，两者共同靶点104个；PPI网络分析确定AKT1、IL6、TNF等核心靶点；GO功能富集分析显示，其主要参与细胞迁移调控、对氧水平反应等生物过程；KEGG通路富集分析表明，PI3K-AKT信号通路是其发挥作用的关键通路。分子对接结果显示，槲皮素、β-谷甾醇和鹅掌楸树脂酚B二甲醚分别与IL-1β、IL-6和TNF-α等均具有良好结合活性。动物实验结果显示，与空白对照组相比，模型对照组大鼠皮肤组织COL1A1、COL1A3表达减少，IL-1β、IL-6 mRNA及蛋白表达升高，创面愈合率低，血清IL-6、IL-1β、TNF-α、MMP-9水平升高，皮肤组织P-PI3K、P-AKT、VEGFA、CD31蛋白表达降低(P<0.05)。与模型对照组相比，肉苁蓉低、高剂量组大鼠皮肤组织COL1A1、COL1A3表达增加，IL-1β、IL-6mRNA及蛋白表达降低，创面愈合率升高，血清IL-6、IL-1β、TNF-α、MMP-9水平降低，皮肤组织P-PI3K、P-AKT、VEGFA、CD31蛋白表达升高(P<0.05)。结论 新疆肉苁蓉乙醇提取物通过激活PI3K-AKT信号通路并减轻炎症反应促进血管生成，为组织愈合的治疗提供新的潜在治疗策略和理论依据。

关键词

肉苁蓉 / 血管生成 / 伤口愈合 / 网络药理学 / PI3K-AKT信号通路