Piezo1突变的斑马鱼模型构建及其在静脉畸形组织中的表达与功能研究

摘要

目的 探讨Piezo1在静脉畸形(Venous malformations, VM)组织中的表达情况以及对血管发育的作用影响。方法 通过调取诊断为VM的临床病例及病理切片作为VM组，正常静脉血管组织作为Control组，应用三重荧光免疫组织化学染色的方法检测兔多克隆抗体血小板-内皮细胞黏附分子(CD31)、小鼠单克隆抗体α-平滑肌激动蛋白(α-SMA)及Piezo1的表达水平及定位；通过CRISPR-Cas9基因编辑技术，构建Piezo1突变基因，显微注射入Tg(fli1a:EGFP)斑马鱼的受精卵中，注射分组为Mutant Piezo1-KD组和Control组，随后在不同胚胎发育时期使用荧光显微镜观察记录血管的发育表型，采用RT-qPCR实验方法分析Piezo1、PI3K、AKT、mTOR基因的表达改变。结果 三重荧光染色的结果提示，Control组与VM组中CD31表达无明显差异(P>0.05);Control组中α-SMA表达高于VM组，且VM组中绿色荧光标记提示血管平滑肌细胞(VSMCs)稀疏纤薄(P<0.01);Piezo1在Control组中可见红色荧光表达明显，广泛分布于内皮细胞(ECs)与VSMCs中，而VM组中可见红色荧光分布明显少于Control组(P<0.05)。动物实验结果提示，Control组斑马鱼胚胎尾静脉丛窦腔分布广泛，窦腔形态大小均一，尾动脉发育正常，Mutant Piezo1-KD组斑马鱼胚胎尾静脉丛窦腔分布稀疏不均一，血管发育畸形，与Control组相比，Mutant Piezo1-KD组Piezo1低表达，差异具有统计学意义(P<0.000 1),而PI3K、AKT、mTOR在Mutant Piezo1-KD组中表达高于Control组，差异具有统计学意义(P<0.000 1)。结论 本研究从临床病理出发，验证了Piezo1在VM组织中表达降低，再通过敲降Piezo1基因，构建斑马鱼动物模型，进一步验证了Piezo1的降低影响血管发育，导致PI3K-AKT-mTOR信号通路相关分子的过表达。

关键词

静脉畸形 / Piezo1 / 斑马鱼 / PI3K-AKT-mTOR信号通路