补肾痹通方调控HIF-1α信号通路抑制膝骨关节炎大鼠软骨细胞凋亡的作用机制研究

摘要

目的 基于缺氧诱导因子1α(Hypoxia inducible factor 1 subunit alpha,HIF-1α)信号通路探讨补肾痹通方对膝骨关节炎(Knee osteoarthritis,KOA)大鼠抑制软骨细胞凋亡的作用机制。方法 采用改良Hulth法构建KOA大鼠模型,将32只造模成功的KOA大鼠随机分为模型组、高剂量组、低剂量组及HIF-1抑制剂组,每组8只,另取8只正常SD大鼠设为空白组。低剂量组和高剂量组分别给予16.34、32.68 g/kg补肾痹通方灌胃,HIF-1抑制剂组在给予32.68 g/kg补肾痹通方灌胃的同时腹腔注射2 mg/kg利非西呱,空白组给予等体积生理盐水灌胃,每天灌胃或注射1次,连续3周。药物干预结束24 h后,脱颈处死各组大鼠,沿髌骨周缘剪开皮肤,完整切取软骨组织。番红固绿染色和大体评分观察关节软骨病理变化;免疫荧光检测大鼠软骨组织Ⅱ型胶原蛋白(Collagen typeⅡ,CollagenⅡ)和骨形态发生蛋白7 (Bone morphogenetic protein-7,BMP-7)荧光强度水平;生化检测大鼠软骨组织活性氧(Reactive oxygen species,ROS)水平;采用酶联免疫吸附法(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)测定大鼠软骨组织炎症因子白细胞介素-1 β(Interleukin-1 beta,IL-1β)、白细胞介素-6(Interleukin-6,IL-6)、肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-alpha,TNF-α)的水平;免疫印记法(Western blot,WB)检测B细胞淋巴瘤-2相关X蛋白(B-cell lymphoma-2 associated X protein,Bax)、B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)、活化型半胱天冬酶-3(cleaved-Caspase3)、HIF-1α蛋白表达情况。结果 与空白组相比,模型组大鼠关节软骨大体评分升高,软骨细胞减少,基质着色减弱,局部缺损;软骨组织中CollagenⅡ、BMP-7荧光表达下调,ROS和炎症因子IL-6、IL-1β、TNF-α水平升高,HIF-1α、cleaved-Caspase3、Bax蛋白表达升高,Bcl-2蛋白表达降低(P均<0.05)。与模型组比较,高剂量组关节软骨大体观察评分降低,软骨细胞数量增加,基质染色较正常,潮线较完整;软骨组织中CollagenⅡ、BMP-7荧光表达上调,ROS和炎症因子IL-6、IL-1β、TNF-α水平降低,HIF-1α、cleaved-Caspase3、Bax蛋白表达降低,Bcl-2蛋白表达升高(P均<0.05)。与高剂量组相比,HIF-1抑制剂组关节软骨大体观察评分降低,大鼠软骨破坏程度减轻,基质着色深;软骨组织中CollagenⅡ、BMP-7荧光表达上调,ROS和炎症因子IL-6、IL-1β、TNF-α水平降低,HIF-1α、cleaved-Caspase3、Bax蛋白表达降低,Bcl-2蛋白表达升高(P均<0.05)。结论 补肾痹通方能有效改善KOA大鼠软骨的病理状况,通过HIF-1α通路抑制KOA大鼠软骨细胞凋亡。

关键词

补肾痹通方 / 膝骨关节炎 / HIF-1α信号通路 / 凋亡 / 炎症