PKM2特异性突变协同免疫检查点重塑食管鳞状细胞癌微环境并促进肿瘤进展

摘要

目的 探讨丙酮酸激酶M2(Pyruvate kinase M2,PKM2)的K367M、R399E不同突变位点对免疫检查点程序性死亡配体1(Programmed death-ligand 1,PD-L1)、程序性死亡配体2(Programmed death-ligand 2,PD-L2)及炎症因子白细胞介素-1α(Interleukin-1α,IL-1α)、白细胞介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)表达的调控作用，分析其在食管鳞状细胞癌(Esophageal squamous cell carcinoma, ESCC)免疫逃逸及肿瘤免疫微环境重塑中的潜在机制。方法 构建KYSE150细胞稳定表达PKM2野生型(PKM2-WT)、PKM2-K367M和PKM2-R399E突变体，以及AKR细胞稳定敲低PKM2(shRNA-PKM2-1、shRNA-PKM2-2)的细胞模型。采用定量磷蛋白组学技术分析PKM2-WT与PKM2-K367M和PKM2-R399E之间的差异磷酸化蛋白。通过流式细胞术验证PKM2-K367M和PKM2-R399E突变体在KYSE150细胞中的表达稳定性，并检测PD-L1、PD-L2、IL-1α和IL-1β的表达水平。采用蛋白免疫印迹法检测表达PKM2-K367M或PKM2-R399E突变体的KYSE150细胞以及shRNA-PKM2-1、shRNA-PKM2-2的AKR细胞中PKM2、PD-L1、PD-L2和IL-1α的蛋白表达。将AKR对照细胞及shRNA-PKM2-1敲低细胞皮下接种C57BL/6N小鼠，每组3只，建立移植瘤模型，测量肿瘤体积和重量，通过免疫组化检测肿瘤组织中PKM2、Ki-67、PD-L1和PD-L2的表达。结果 构建稳定表达PKM2野生型(PKM2-WT)、PKM2-K367M及PKM2-R399E突变体的人食管鳞癌KYSE150细胞株，以及稳定敲低PKM2的鼠源AKR细胞株。与PKM2-WT组相比，PKM2-R399E组IL-1α上调，PKM2-K367M和PKM2-R399E组普列克底物蛋白和Sec7结构域蛋白3(PSD3)上调，PD-L1、PD-L2、IL-1α和IL-1β的表达均升高(P<0.05)。与Control组比较，shRNA-PKM2-1、shRNA-PKM2-2组AKR细胞中PKM2、PD-L1、PD-L2、IL-1α的蛋白表达均降低(P<0.05)。体内实验中，与Control组比较，shRNA-PKM2-1组肿瘤重量降低，细胞质中PD-L1、PD-L2及细胞核中Ki-67的表达均降低(P<0.05)。结论 PKM2不同突变位点可通过差异性调控PD-L1、PD-L2及IL-1α、IL-1β的表达，并伴有PSD3上调，提示PKM2通过免疫-代谢机制参与ESCC免疫检查点调控及肿瘤免疫微环境重塑。

关键词

丙酮酸激酶M2 / 程序性死亡配体1 / 食管鳞状细胞癌