ZDE-1调控p62降解与自噬流抑制心肌成纤维细胞纤维化的实验研究

摘要

目的 探讨ZDE-1与自噬接头蛋白SQSTM1/p62的靶向调控关系，明确其通过调控SQSTM1/p62介导的自噬流缓解心肌纤维化的分子机制。方法 采用CCK-8法检测ZDE-1对心肌细胞活力的影响；免疫荧光技术检测ZDE-1干预后心肌细胞内p62蛋白成点数量的变化。为明确ZDE-1对细胞自噬流的调控效应，以p62和LC3-Ⅱ为自噬流核心检测指标，结合自噬通路特异性抑制剂(溶酶体降解抑制剂BafA1、自噬起始抑制剂3-MA)进行干预，采用蛋白免疫印迹法检测各指标表达变化。采用蛋白免疫印迹技术检测ZDE-1处理后细胞中p62、LC3-II以及p-p70S6K、p-AMPK的表达水平；实验分为以下各组：空白对照组、2.5μmol/L ZDE-1单独处理组、2.5μmol/L ZDE-1+50 nmol/L BafA1联合处理组、2.5μmol/L ZDE-1+100nmol/L Rapa联合处理组、2.5μmol/L ZDE-1+10 mmol/L 3-MA联合处理组。在抗纤维化实验中，采用蛋白免疫印迹法检测不同处理组细胞中CollagenⅠ和α-SMA的表达水平，实验分为：空白对照组、10 ng/mL TGF-β单独处理组，以及2.5、5、10μmol/L ZDE-1分别联合10 ng/mL TGF-β处理组。结果 以2.5、5、10、20μmol/L ZDE-1干预4 h为诱导心肌细胞自噬的最优方案。与对照组相比，ZDE-1处理后p62小体成点数量明显增加(P<0.05),p62蛋白表达水平下调(P<0.05),LC3-Ⅱ表达水平上调(P<0.001)。相较于空白对照组，2.5μmol/L ZDE-1与50 nmol/L BafA1联合处理组的LC3-Ⅱ表达上调(P<0.01),2.5μmol/L ZDE-1与10 mmol/L 3-MA联合处理组的LC3-Ⅱ表达量下调(P<0.01)。p62蛋白表达方面，2.5μmol/L ZDE-1与BafA1联合处理组p62表达上调(P<0.05),2.5μmol/L ZDE-1与3-MA联合处理组p62表达下调(P<0.01)。相较于空白对照组，ZDE-1单独处理组(P<0.01)、ZDE-1与BafA1联合处理组(P<0.001)、ZDE-1与Rapa联合处理组(P<0.001)以及ZDE-1与3-MA联合处理组(P<0.05)中蛋白p-p70S6K表达量均降低。相较于空白对照组，在ZDE-1单独处理组(P<0.01)、ZDE-1与BafA1联合处理组(P<0.001)、ZDE-1与Rapa联合处理组(P<0.01)以及ZDE-1与3-MA联合处理组(P<0.01)中蛋白p-AMPK表达量均升高。在TGF-β诱导的心肌成纤维细胞中，2.5μmol/L ZDE-1能够明显降低α-SMA和CollagenⅠ的蛋白表达，使其恢复到正常水平(P<0.05)。结论 2.5μmol/L浓度的ZDE-1干预心肌细胞无细胞毒性，其可通过下调p62表达水平、增加p62小体成点数量，经AMPK通路激活SQSTM1/p62介导的自噬并维持自噬流通畅，进而显著抑制TGF-β诱导的心肌成纤维细胞纤维化，缓解心肌纤维化进程。

关键词

自噬相关蛋白p62 / 心肌纤维化 / 化合物ZDE-1