纳米氧化锌诱导骨肉瘤细胞凋亡的分子机制研究

摘要

目的 探讨纳米氧化锌（Zinc oxide nanoparticles, ZnO NPs）对骨肉瘤细胞（MG-63、HOS）的增殖抑制与凋亡诱导作用及其分子机制。方法 采用10、20、30、40、50μg/mL ZnO NPs分别处理人骨肉瘤细胞系MG-63、HOS及正常成骨细胞（MC3T3-E1）后，通过细胞计数试剂盒-8（Cell counting kit-8,CCK-8）实验检测细胞活力，并计算半数抑制浓度(Half-maximal inhibitory concentration, IC₅₀)。选取对照组、10μg/mL和20μg/mL ZnO NPs组，采用平板克隆形成实验评估MG-63、HOS细胞的增殖和克隆形成能力；钙黄绿素-乙酰甲氧基甲酯/碘化丙啶（Calcein-AM/propidium iodide, Calcein-AM/PI）活死细胞染色对MG-63、HOS细胞存活与死亡状态进行定性观察；膜联蛋白V-藻红蛋白/7-氨基放线菌素D（Annexin V-PE/7-aminoactinomycin D,Annexin V-PE/7-AAD）双染流式细胞术定量检测MG-63、HOS细胞凋亡率；实时荧光定量聚合酶链式反应和蛋白质免疫印迹法分别从mRNA和蛋白水平检测MG-63、HOS细胞抗凋亡蛋白B细胞淋巴瘤2蛋白（B-cell lymphoma 2,Bcl-2）、促凋亡蛋白Bcl-2相关X蛋白（Bcl-2 associated X protein, Bax）、细胞色素C（Cytochrome C,Cyt C）、半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶3（Cysteine aspartate specific protease-3,Caspase-3）及剪切型半胱氨酸蛋白酶-3（Cleaved cysteine aspartate protease-3,Cleaved-Caspase3）的表达水平。结果 ZnO NPs对MG-63、HOS细胞活力的抑制作用强于MC3T3-E1（P<0.001）,其24 h的IC₅₀值分别为19.65μg/mL和22.39μg/mL,低于MC3T3-E1细胞的33.70μg/mL（P<0.001）。与对照组相比，10μg/mL和20μg/mL ZnO NPs组MG-63、HOS细胞的克隆形成数减少，细胞克隆增殖能力明显降低（P<0.01）。Calcein-AM/PI活死细胞染色可见，两种骨肉瘤细胞中死细胞数量增多，细胞密度降低，部分细胞出现皱缩变圆、从培养皿脱落等形态学改变。Annexin V-PE/7-AAD双染流式细胞术检测表明，20μg/mL ZnO NPs组MG-63、HOS细胞总凋亡率分别为（50.60±2.90）%和（44.76±2.28）%（P<0.001）。20μg/mL ZnO NPs组可上调促凋亡基因Bax、线粒体凋亡关键因子Cyt C及Caspase-3的mRNA表达，下调抗凋亡基因Bcl-2的mRNA表达（P均<0.01）;蛋白水平上，20μg/mL ZnO NPs组可上调Bax、Cyt C及Cleaved-Caspase3的表达，下调Caspase-3及Bcl-2的表达（P均<0.01）。结论 ZnO NPs可通过损伤线粒体功能激活内源性凋亡途径，有效抑制骨肉瘤细胞的增殖，促进其凋亡。

关键词

纳米氧化锌 / 骨肉瘤 / 细胞凋亡 / 细胞增殖 / 内源性凋亡