Rab4调控p62介导选择性自噬的机制研究

摘要

目的 探讨Ras相关蛋白4(Rab4)缺失对自噬接头蛋白(SQSTM1/p62)形成和降解的影响。方法 采用CRISPR-Cas9技术在正常大鼠肾上皮(NRK)细胞中构建Rab4A/B双敲除(DKO)细胞系；蛋白免疫印迹验证Rab4敲除效率并检测p62蛋白和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)蛋白表达水平；免疫荧光观察p62亚细胞定位，以及嘌呤霉素(Pur)处理24 h后再经正常培养24 h时p62的降解情况；通过微红色荧光蛋白(mRFP)-绿色荧光蛋白(GFP)-微管相关蛋白1轻链3(LC3)、Halo-强化绿荧光蛋白(EGFP)-p62双荧光探针活细胞成像，结合染料淬灭型牛血清白蛋白(DQ-BSA)荧光试剂检测溶酶体降解活性；联用溶酶体绿色荧光探针DND-189与溶酶体示踪剂红DND-99双色探针检测溶酶体pH;细胞计数试剂盒-8(CCK-8)检测嘌呤霉素处理8 h后48 h内的细胞增殖差异。结果 成功建立Rab4 DKO细胞系：免疫荧光结果显示，与WT细胞相比，Rab4 DKO细胞中p62蛋白出现核周聚集现象(P<0.001),且在Rab4 DKO细胞中重新转入GFP-Rab4后p62核周聚集分布现象消失；与WT细胞相比，Rab4 DKO细胞中p62蛋白表达量升高(P<0.01);Rab4 DKO细胞中p62蛋白发生液液相分离(LLPS)形成p62体且与LAMP1蛋白共定位(P<0.001);Rab4 DKO细胞中的溶酶体pH高于WT细胞(P<0.000 1);Rab4 DKO细胞中的溶酶体降解能力低于WT细胞(P<0.001);Rab4 DKO细胞在Pur处理后细胞降解恢复能力低于WT细胞(P<0.01);Rab4 DKO细胞与WT细胞在Pur处理后细胞增殖率降低(P<0.001)。结论 Rab4通过调控溶酶体的酸性环境参与p62介导的选择性自噬。Rab4基因缺失会导致溶酶体pH值升高、p62蛋白积累以及溶酶体降解能力减弱，使p62降解受阻，进而下调细胞自噬功能。

关键词

Rab4 / 溶酶体酸性环境 / p62体 / 选择性自噬