细粒棘球蚴外泌体来源egr-miR-71-5p对肝星状细胞的调控作用及机制研究

摘要

目的 探究细粒棘球蚴外泌体来源的egr-miR-71-5p对人肝星状细胞系(LX2)活化的调控作用及转化生长因子-β(TGF-β)/SMAD信号通路机制，为细粒棘球蚴病防治提供潜在靶点。方法 对课题组前期测序数据进行生物信息学分析，筛选出高表达的egr-miR-71-5p;采用差速离心法分离细粒棘球蚴外泌体，通过透射电镜、粒径检测、蛋白免疫印迹(选用CD63、TSG101标志物)完成鉴定；通过PKH67荧光示踪实验证实LX2细胞对该外泌体的内吞能力，实时荧光定量PCR(RT-qPCR)验证egr-miR-71-5p在外泌体和LX2细胞的表达情况；设计合成egr-miR-71-5p的模拟物(mimic)、抑制剂(inhibitor)及对应阴性对照和阴性荧光对照并转染LX2细胞，镜下观察荧光强度判断转染效率，RT-qPCR验证egr-miR-71-5p转染效率；细胞分组后，采用RT-qPCR、蛋白免疫印迹检测纤维化相关标志物α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin, α-SMA)、Ⅰ型胶原蛋白(CollagenⅠ)、视黄酰基转移酶(Lecithin retinol acyltransferase, LRAT)和TGF-β/SMAD通路分子TGF-β、磷酸化SMAD2/3(Phosphorylated SMAD2/3,p-SMAD2/3)、SMAD4的基因与蛋白表达水平。结果 生物信息学分析显示egr-miR-71-5p在细粒棘球蚴外泌体中高丰度表达，RT-qPCR验证结果一致；成功分离鉴定细粒棘球蚴外泌体，PKH67荧光示踪实验证实LX2细胞可高效内吞该外泌体且胞内检测到egr-miR-71-5p表达；转染后，模拟物组egr-miR-71-5p表达量较阴性对照组升高约16 777倍(P<0.000 1),α-SMA、CollagenⅠ、TGF-β、p-SMAD2/3、SMAD4的基因与蛋白表达水平降低(P<0.000 1),LRAT表达升高(P<0.000 1);外泌体+抑制剂组上述指标呈相反表达趋势(P<0.000 1)。结论 细粒棘球蚴外泌体来源的egr-miR-71-5p通过抑制TGF-β/SMAD信号通路，进而抑制LX2细胞活化进程，该miRNA有望成为细粒棘球蚴病相关肝纤维化的潜在诊断标志物及潜在靶点。

关键词

细粒棘球蚴 / 外泌体 / egr-miR-71-5p / 肝星状细胞 / TGF-β/SMAD通路