基于网络药理学探讨肉苁蓉苯乙醇苷对布鲁氏菌病的免疫作用机制

摘要

目的 基于网络药理学方法探究肉苁蓉苯乙醇苷(CPhGs)抗布鲁氏菌病的免疫机制。方法 通过数据库检索CPhGs活性成分、活性成分作用靶点及抗布鲁氏菌病相关靶点；利用Venny 2.1.0工具获得CPhGs活性成分抗布鲁氏菌病的潜在核心交集靶点。构建蛋白质-蛋白质相互作用和“活性成分-靶点-通路”网络，筛选出Degree值排名前10的关键靶点；对潜在核心交集靶点进行基因本体论(GO)功能和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析；对CPhGs活性成分与布鲁氏菌病的核心关键靶点进行分子对接模拟；在RAW264.7细胞中加入100μL 1×10～8CFU/mL羊种布鲁氏菌16M菌液，孵育2 h构建布鲁氏菌感染模型；将感染细胞分为Model组、Doxycycline组(10μL/mL多西环素)、CPhGs-L组(10μg/mL CPhGs)和CPhGs-H组(100μg/mL CPhGs),另设置正常Control组；药物干预24 h后，采用试剂盒检测细胞上清中炎症因子IL-6、TNF-α的含量；通过Griess法测定细胞上清中一氧化氮(NO)浓度；检测细胞胞内细菌载量，分析细胞上清NO含量与胞内细菌载量的相关性；免疫荧光染色观察细胞胞内布鲁氏菌荧光强度；蛋白免疫印迹法检测细胞中TLR4、P-NF-κB p65/NF-κB p65、HIF-1α、NOS2蛋白的表达水平。结果 筛选得到15个CPhGs类活性成分，获得43个CPhGs与布鲁氏菌病的潜在核心交集靶点，并筛选出IL-6、TNF、HIF1A、TLR4等10个关键靶点；潜在核心交集靶点富集于免疫炎症相关生物学过程、细胞膜组分及细胞因子受体活性等功能及HIF-1、类风湿关节炎、恰加斯病等感染免疫通路；顺式毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷、松果菊苷和肉苁蓉苷A等与IL-6、TNF、HIF1A、TLR4均具有较强的结合能力。与Model组相比，Doxycycline组细胞TNF-α和IL-6含量降低，CPhGs-L组和CPhGs-H组细胞TNF-α和IL-6含量升高；Doxyccline组、CPhGs-L组和CPhGs-H组细胞NO含量升高，细胞胞内细菌载量降低，相对荧光强度减弱，TLR4、P-NF-κB p65/NF-κB p65、HIF-1α及NOS2蛋白表达升高(P<0.05)。细胞上清液NO浓度与胞内细菌载量呈显著负相关(r=-0.73,95%置信区间：-0.920 5～-0.278 4,P<0.05)。结论 顺式毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷、松果菊苷和肉苁蓉苷A等是CPhGs抗布鲁氏菌病的关键活性成分，这些成分通过协同调控HIF1A、TNF、IL6、TLR4等关键靶点，激活TLR4/NF-κB和HIF-1α/NOS2通路增强巨噬细胞免疫功能，从而发挥抗布鲁氏菌病的作用。

关键词

肉苁蓉苯乙醇苷 / 网络药理学 / 布鲁氏菌病 / 免疫作用机制

基金资助

国家自然科学基金项目(82360394,82460399); 中央引导地方科技发展基金项目(ZYYD2025ZY19)