MED12、IP3R1在二乙酰吗啡致心肌细胞凋亡中的作用研究

摘要

目的 探究中介体复合物亚基12（Mediator complex subunit 12,MED12）和肌醇1,4,5-三磷酸受体1型（Inositol 1,4,5-trisphosphate receptor type 1,IP3R1）在二乙酰吗啡致心肌凋亡中的作用。方法 基于前期串联质谱标记相对定量蛋白质组学技术（Tandem mass spectrometry labeling of relative quantitative proteomics techniques, TMT）所得数据，将二乙酰吗啡干预组（DA）与对照组（CON）之间检测到的全部蛋白按照log₂FC值进行排序，采用基因集富集分析（GSEA）评价通路富集情况。以P<0.05、FC>1.2为标准筛选两组之间的上调差异蛋白；从GeneCards数据库获取凋亡和钙信号通路相关基因集，采用韦恩分析筛选上调差异蛋白与基因集的共同差异蛋白，并结合火山图展示候选蛋白。从GTRD和ChIP-Atlas数据库获取IP3R1上游转录调控分子，与TMT蛋白质组学全部差异蛋白（P<0.05、FC>1.2或<0.833 5）和凋亡相关基因集进行交集分析，筛选候选上游调控因子。体外培养SD乳鼠原代心肌细胞，采用0、100、200、300、400、500、600、700、800、900和1 000μg/mL二乙酰吗啡干预24 h,以细胞计数试剂盒-8法检测细胞活力并筛选后续给药浓度。设置Control组和DA组（900μg/mL二乙酰吗啡）,采用结晶紫染色观察细胞形态；实时荧光定量聚合酶链反应（RT-qPCR）检测原代心肌细胞中MED12、IP3R1、B细胞淋巴瘤2（B-cell lymphoma 2,Bcl2）、Bcl2相关X蛋白（Bcl2-associated X protein, Bax）mRNA表达，蛋白质免疫印迹检测MED12、IP3R1、Bax、Bcl2、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9（Cysteinyl aspartate-specific protease-9,Caspase-9）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Cysteinyl aspartate-specific protease-3,Caspase-3）和电压依赖性阴离子通道1（Voltage-dependent anion channel 1,VDAC1）蛋白表达。建立二乙酰吗啡成瘾SD大鼠模型，将12只雄性SD大鼠随机分为NS组（皮下注射等体积生理盐水）和Drug组（初始二乙酰吗啡5 mg/kg,递增剂量为2 mg/kg,连续20 d）,每组6只。采用苏木精-伊红染色观察心肌组织病理形态，RT-qPCR检测心肌组织中MED12、IP3R1、Bax、Bcl2 mRNA表达，蛋白质免疫印迹检测心肌组织中MED12、IP3R1、Bax、Bcl2、Caspase-9、Caspase-3、VDAC1蛋白表达。结果 GSEA结果显示，二乙酰吗啡干预后钙信号通路显著上调。筛选获得75个凋亡-钙信号相关差异蛋白，结合差异表达及功能注释，选择IP3R1作为候选验证蛋白。进一步基于GTRD和ChIP-Atlas数据库预测结果结合凋亡相关基因集，优先筛选MED12作为IP3R1潜在上游调控分子。900μg/mL二乙酰吗啡干预24 h后，原代心肌细胞活力降至约50%（P<0.001）。与Control组相比，DA组细胞数量减少，细胞轮廓皱缩，形态不规则，细胞间隙增大，MED12和Bcl2 mRNA及蛋白表达降低，IP3R1和Bax mRNA及蛋白表达升高，Caspase-9、Caspase-3和VDAC1蛋白表达升高（P<0.05）。与NS组相比，Drug组心肌纤维排列紊乱并出现局部断裂，心肌组织中MED12和Bcl2 mRNA及蛋白表达降低，IP3R1和Bax mRNA及蛋白表达升高，Caspase-9、Caspase-3和VDAC1蛋白表达升高（P<0.05）。结论 MED12、IP3R1与二乙酰吗啡诱导的心肌细胞凋亡相关，提示二者可能参与二乙酰吗啡致心肌细胞凋亡过程。

关键词

心肌细胞凋亡 / 二乙酰吗啡 / 中介体复合物亚基12 / 肌醇1,4,5-三磷酸受体1型

基金资助

国家自然科学基金地区科学基金项目(82460257); 新疆医科大学法医学重点实验室开放课题项目(FY2025-KCS05)