机械应力下自噬与线粒体自噬动态变化在TMJOA软骨细胞衰老的初步研究

摘要

目的 探讨机械应力条件下自噬与线粒体自噬动态变化在大鼠颞下颌关节骨关节炎（Temporomandibular joint osteoarthritis, TMJOA）软骨细胞衰老中的可能作用机制。方法 对SD大鼠髁突软骨细胞施加7 dyne/cm²流体剪切力（Fluid flow shear stress, FFSS）2 h,采用线粒体自噬抑制剂环孢素A（Cyclosporin A,CsA）进行干预。检测细胞丙二醛（Malodialdehyde, MDA）和谷胱甘肽（Glutathione, GSH）含量以评价细胞抗氧化能力；采用JC-1试剂盒染色检测软骨细胞线粒体膜电位变化；采用2′,7′-二氯二氢荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）试剂盒染色检测细胞内活性氧（Reactive oxygen species, ROS）水平；对软骨细胞进行细胞衰老相关β-半乳糖苷酶染色；采用RT-qPCR法检测促炎因子肿瘤坏死因子-α（TNF-α）,自噬标志物微管相关蛋白1轻链3β（LC3B）、线粒体自噬PTEN诱导激酶1（PINK1）/帕金蛋白（Parkin）通路以及衰老相关p16、p21基因表达；采用蛋白质免疫印迹法（Western blot）分析测定促炎因子TNF-α,自噬标志物LC3B、线粒体自噬标志物PINK1、Parkin以及衰老相关p16、p21蛋白表达。构建雄性SD大鼠单侧前牙反牙合（Unilateral anterior crossbite, UAC）模型，分为Control组和UAC组，每组设置两个时间节点：28 w和34 w。对动物标本进行HE染色和番红O-固绿染色，采用免疫组织化学法检测促炎因子白细胞介素-1β（Interleukin-1β,IL-1β）、自噬标志物LC3B、线粒体自噬PINK1/Parkin通路以及衰老相关蛋白p21的表达。结果 与Control组比较，7 dyne/cm²组JC-1染色绿色荧光增强、红色荧光减弱，表明线粒体膜电位降低。与Control组比较，7 dyne/cm²组细胞MDA含量呈增加趋势，但差异无统计学意义（P>0.05）,GSH含量降低（P<0.000 1）。DCFH-DA染色显示细胞内ROS含量增加（P<0.001）。β-半乳糖苷酶染色显示细胞蓝染，出现细胞衰老。RT-qPCR检测显示，与Control组比较，7 dyne/cm²组细胞中TNF-α和Parkin mRNA表达呈降低趋势但差异无统计学意义（P>0.05）,而LC3B mRNA表达升高（P<0.01）,PINK1 mRNA表达降低（P<0.001）。与Control组比较，7 dyne/cm²组细胞p16及p21蛋白表达显著升高（P<0.05）,而相应mRNA表达差异无统计学意义。体内动物实验中，HE染色结果显示，与同周龄Control组比较，28 w UAC组和34 w UAC组髁突软骨厚度显著变薄，软骨细胞排列紊乱。番红O-固绿染色结果显示，与Control组比较，UAC组软骨基质红色染色强度变弱，着色不均，软骨细胞排列紊乱、数量减少，软骨层变薄。免疫组织化学检测结果显示，与Control组相比，UAC组的p21、PINK1、IL-1β表达均呈增加趋势，其中p21、IL-1β的表达差异具有统计学意义（P<0.01）,同周龄条件下，UAC组表达高于Control组。结论 机械应力可诱导TMJOA软骨细胞发生自噬、线粒体自噬及细胞衰老相关动态的变化，自噬与线粒体自噬可能在TMJOA发生发展过程中发挥重要调控作用。

关键词

颞下颌关节骨关节炎 / 异常咬合力 / 流体剪切力 / 线粒体自噬 / 细胞衰老

基金资助

新疆维吾尔自治区卫生健康科技计划项目(2026001CXKYXM65014598); 新疆维吾尔自治区自然科学基金面上项目(2022D01A37)