KLHL21改善心肌细胞氧糖剥夺损伤的作用研究及其与Nrf2的关联性分析

摘要

目的 探讨Kelch样蛋白家族成员21(Kelch-like protein family member21,KLHL21)过表达对氧糖剥夺(Oxygen-glucose deprivation, OGD)诱导的AC16心肌细胞损伤的保护作用，并分析KLHL21与核因子E2相关因子2(Nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2)的关联性。方法 本研究以AC16心肌细胞为研究对象，设常规培养为对照组，实验组采用无糖无血清培养基并置于缺氧小室内，分别缺氧处理2、4、6、8 h以建立OGD模型，检测各组细胞活力及KLHL21蛋白表达水平。采用慢病毒载体构建KLHL21稳定过表达的AC16心肌细胞系。实验分为4组：阴性对照转染组(Negative control, NC)、KLHL21过表达转染组(KLHL21 overexpression, KLHL21OE)、阴性对照转染+OGD处理组(NC+OGD)、KLHL21过表达转染+OGD处理组(KLHL21OE+OGD)。检测细胞活力、细胞内活性氧(Reactive oxygen species, ROS)水平、丙二醛(Malondialdehyde, MDA)、谷胱甘肽(Glutathione, GSH)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase, SOD)的活性及线粒体形态；检测KLHL21、Nrf2、谷胱甘肽过氧化物酶4(Glutathione peroxidase 4,GPX4)、及溶质载体家族7成员11(Solute carrier family 7 member 11,SLC7A11)的蛋白表达水平；并运用分子对接、免疫荧光和免疫共沉淀实验验证KLHL21与Nrf2的相互作用。结果 OGD处理后，AC16心肌细胞活力呈时间依赖性下降，KLHL21蛋白表达水平降低(P<0.05),后续实验选取OGD处理4 h进行干预。常氧条件下，NC组与KLHL21OE组各项指标差异无统计学意义(P>0.05)。与NC+OGD组比较，KLHL21OE+OGD组MDA水平降低，SOD、GSH活性升高；MitoBright LT染色显示线粒体损伤程度减轻，ROS生成减少；Nrf2、GPX4及SLC7A11蛋白表达水平上调，差异均有统计学意义(P<0.05)。分子对接结果显示，KLHL21与Nrf2存在稳定相互作用(结合能为-14.8kcal/mol),免疫荧光染色显示两者在细胞质内共定位，免疫共沉淀证实两者存在蛋白相互作用。结论 KLHL21过表达通过与Nrf2相互作用、上调Nrf2/GPX4通路表达，减轻AC16心肌细胞氧化应激及线粒体损伤，为缺血性心肌损伤的潜在保护靶点。

关键词

Kelch样蛋白家族成员21 / 氧糖剥夺 / 核因子E2相关因子2 / 氧化应激

基金资助

国家自然科学基金项目(82170345); 新疆维吾尔自治区自然科学基金青年项目(2023D01C233)