TAT穿膜肽的布鲁氏菌多表位疫苗构建及免疫反应特点

摘要

目的 基于生物信息学方法设计一种融合穿膜肽TAT的布鲁氏菌多表位重组疫苗（TAT-MEV）,并在人外周血单个核细胞（PBMC）水平评估其诱导细胞免疫应答的能力。方法 筛选布鲁氏菌IV型分泌系统（T4SS）相关蛋白（VirB2、VirB3、VirB6及BtpA）中适配新疆人群高频HLA分子的优势辅助性T细胞表位、细胞毒性T细胞表位及B细胞线性表位，并在N端融合穿膜肽TAT构建重组疫苗TAT-MEV。通过生物信息学方法预测其理化性质、空间构象，并利用分子对接与动力学模拟评估其与Toll样受体4（TLR4）的结合稳定性。构建重组表达质粒pET-28a（+）-TAT-MEV并进行原核表达与纯化。体外分离并培养人PBMC,采用纯化后的TAT-MEV重组蛋白进行刺激，利用流式微球阵列技术检测上清中干扰素-γ和白介素-4的分泌水平，并通过流式细胞术检测CD3⁺T细胞及其CD4⁺、CD8⁺、CD4^-CD8^-双阴性T细胞亚群的百分比变化。结果 TAT-MEV（分子量45 kDa）理化性质稳定且溶解性良好，三级结构评估z-score为-8.47,与TLR4受体对接置信度达0.989 0且简正动力学构象稳定，成功通过原核表达纯化，经Western Blot验证特异性良好。细胞实验结果显示，与PBS组相比，TAT-MEV组PBMC中IFN-γ与IL-4的分泌水平升高（P<0.01）,TAT-MEV组CD3⁺T、CD8⁺T及CD4^-CD8^-T细胞百分比升高，CD4⁺T细胞百分比降低（P<0.001）。结论 TAT-MEV具备优良的理化性质与受体结合稳定性，能够通过协同促进CD8⁺T细胞与CD4^-CD8^-双阴性T细胞的活化与增殖，在人细胞水平诱导Th1型偏向性细胞免疫反应，为开发具备胞内高效递送及强细胞免疫原性的新型布鲁氏菌疫苗奠定了理论与实验基础。

关键词

布鲁氏菌 / TAT穿膜肽 / 生物信息学 / Th1型免疫应答

基金资助

新疆维吾尔自治区杰出青年科学基金项目(2023D01E12); 中央引导地方科技发展基金项目(ZYYD2025ZY19)