褪黑素调控节律基因表达及其缓解间质性肺纤维化的机制

摘要

目的：研究褪黑素(melatonin, MT)干预肺纤维化患者节律基因表达，并分析其缓解肺纤维化疾病进展的机制。方法：通过高通量基因表达数据库(Gene Expression Omnibus, GEO)筛选肺纤维化患者与健康对照组之间差异表达的生物钟基因，分析节律基因与肺功能及肺纤维化相关基因之间的相关性。构建博来霉素(bleomycin, BLM)诱导小鼠肺纤维化模型，通过测序及免疫组织化学染色观察BLM组以及使用MT干预后(BLM+MT组)肺组织PER2、CRY2表达的差异，通过HE染色及Masson染色观察MT对肺纤维化的影响。用Western blot检测转化生长因子β(transforming growth factor β,TGF-β)诱导肺上皮细胞P-smad2/3的表达，采用实时荧光定量逆转录PCR技术，探究对照组、TGF-β组、TGF-β+MT组生物钟基因的节律表达变化，最后通过MT受体阻滞剂luzindole干预TGF-β+MT组的肺上皮细胞，通过Western blot探究MT减轻TGF-β诱导上皮-间质转化的受体依赖性。结果：(1)通过对GEO数据集的分析发现，节律基因PER2和CRY2与TGF-β的表达存在负相关性，且与患者肺功能指标存在正相关性。(2)小鼠肺组织转录组测序分析发现BLM组PER2和CRY2的表达较正常组明显减少。同时，病理染色结果显示正常组小鼠肺组织结构完整清晰，肺泡间隔薄；BLM组中肺组织出现大量胶原纤维增生，肺泡结构紊乱；与BLM组相比，BLM+MT组胶原纤维增生及炎性细胞浸润减少；免疫组化染色结果提示BLM组PER2和CRY2的表达量比正常组降低，BLM+MT组比BLM组增加。(3)肺上皮细胞体外TGF-β干预实验结果表明，相较于对照组，TGF-β组P-smad2/3表达量增加，MT干预抑制了TGF-β对P-smad2/3的诱导作用，而MT受体阻滞剂干预又逆转了这一现象，说明MT可以抑制TGF-β通路激活，且该过程存在MT受体依赖性。(4)肺上皮细胞48 h节律实验结果显示，TGF-β+MT组中PER2和CRY2的mRNA节律接近24 h,且有向对照组节律恢复的趋势，而在加入MT受体阻断剂后，其节律的时程和振幅均趋向于TGF-β组。结论：MT通过与其受体结合，可以恢复正常生物钟基因PER2和CRY2的周期性表达，进而抑制TGF-β经典通路的激活，抑制肺纤维化上皮-间质转化病理进程。这一发现为肺纤维化的治疗提供了新的分子靶点和潜在的治疗策略。

关键词

褪黑素 / 节律基因 / 肺纤维化