多重qRT-PCR检测犊牛腹泻病方法的建立与应用

摘要

[目的]建立一种检测犊牛腹泻病多重qRT-PCR方法，旨在对致犊牛腹泻的多种病原体同时快速检测。[方法]查询多种致犊牛腹泻的病原体保守基因序列作为靶标基因，设计特异性引物和探针，构建质粒标准品，优化引物浓度和退火温度，测试其灵敏度、特异性和临床样本验证。[结果]以10³拷贝/μL质粒作为标准品，成功建立检测犊牛腹泻病多重q RT-PCR方法，反应体系为：10μL 2×Fast-Start Universal SYBR Green Master,0.5μL上游引物，0.5μL下游引物，1μL模板，8μL灭菌超纯水，总反应体积为20μL。反应条件为：95℃3 min;94℃ 20 s、56℃ 15 s、72℃ 30 s,36个循环；72℃ 5 min。检测犊牛腹泻病多重qRT-PCR方法的灵敏度为1拷贝/μL，与常见其他病原体无交叉反应，组内和组间变异系数均小于2%。在315份腹泻犊牛的临床粪便样本中，共检测出248份阳性（78.73%）,42份为混合感染阳性（13.33%），与单一PCR方法的阳性检出率结果完全一致。[结论]本研究成功建立一种可同时检测6种犊牛腹泻病原体的多重q RT-PCR方法，对质粒DNA的检测灵敏度可达1拷贝/μL，与常见其他病原体无交叉反应，与单一PCR方法对315份临床样本的检测符合率为100%。

关键词

犊牛 / 腹泻 / 多重qRT-PCR / 检测 / 病原体