慢病毒载体介导Gag-Caspase-8诱导三阴性乳腺癌原代细胞凋亡及S期阻滞

摘要

目的 探讨携Gag-Caspase-8慢病毒样颗粒对三阴性乳腺癌原代细胞增殖、迁移、周期和凋亡的影响及作用机制。方法 收集临床人乳腺癌标本3例，通过改良组织块培养法培养人乳腺癌原代细胞，通过HE染色、免疫组化及免疫荧光鉴定所培养的细胞是否为高纯度三阴性人乳腺癌原代细胞；慢病毒转染构建携Gag-Caspase-8慢病毒样颗粒，细胞分为PBS组、Gag-VLPs组和Gag-CASP8-VLPs组。采用MTT法评估细胞增殖，划痕实验检测细胞迁移能力，AO/EB染色检测细胞凋亡，流式细胞术分析细胞周期和凋亡，蛋白质免疫印迹考察凋亡相关蛋白表达。结果 临床肿瘤标本经HE染色确定为乳腺癌病理组织，免疫组化鉴定乳腺癌原代细胞特异性分子标记物CA153阳性高表达，并通过计算阳性细胞比例评估细胞纯度约为98%,免疫荧光检测结果显示，HER2、ER、PR均阴性表达，证明所培养的细胞为高纯度三阴性人乳腺癌原代细胞；Western blotting检测发现构建的Gag-VLPs和Gag-CASP8-VLPs内有慢病毒载体特异性分子标志物P24表达，证明慢病毒样颗粒包装成功。Gag-CASP8-VLPs干预三阴性人乳腺癌原代细胞24、48 h后，与对照组PBS和Gag-VLPs相比，倒置显微镜下观察到细胞皱缩、体积减小、贴壁能力下降且漂浮细胞增多；MTT检测显示，Gag-CASP8-VLPs组显著抑制了人乳腺癌原代细胞的生长(P<0.01),并呈时间依赖性；细胞划痕实验观察到，Gag-CASP8-VLPs组可显著抑制人乳腺癌原代细胞的迁移能力(P<0.05);流式细胞术检测发现，Gag-CASP8-VLPs组S期细胞数量显著增高(P<0.01),细胞阻滞于S期；AO/EB染色及流式细胞术检测发现，Gag-CASP8-VLPs组可诱导细胞发生凋亡(P<0.01);Western blotting结果显示，Gag-CASP8-VLPs组三阴性乳腺癌原代细胞内Gag-Caspase-8、Pro caspase-8、Activecaspase-8和Caspase-3凋亡相关蛋白表达显著增高(P<0.01)。结论 慢病毒介导Gag-Caspase-8将活化的Caspase-8导入三阴性乳腺癌原代细胞，通过激活下游Caspase-3,诱导细胞凋亡，并使细胞停滞在S期，从而抑制细胞增殖和迁移。

关键词

慢病毒载体 / Gag-Caspase-8 / 三阴性人乳腺癌原代细胞 / Caspase-8 / S期阻滞

基金资助

贵州省科技厅基础研究计划(自然科学类)科技基金项目(黔科合基础-ZK[2024]一般403); 贵州中医药大学研究生教育创新计划项目(YCXKYB2023011);贵州中医药大学研究生科研基金项目(YCXKYS2024008);贵州中医药大学学术新苗项目(贵科合学术新苗[2023]-04号);贵州中医药大学护理学院院级项目(HL2406003); 贵州省教育厅高等学校自然科学研究项目(青年科技人才成长项目)(黔教技[2024]120号); 2023年贵州省中医药、民族医药重点学科项目[QZYYZDXK(JS)-2023-02]; 遵义市科技与大数据局联合基金项目(遵市科合HZ字[2023]175号); 贵州省大学生创新训练项目(S2024106621541); 贵州省卫生健康委科技基金项目(gzwkj2025-347)