飞行时间质谱在耐药结核病检测中的应用价值

摘要

目的 旨在建立一种基于基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry, MALDI-TOF-MS)平台鉴定结核分枝杆菌及检测结核耐药突变位点的方法，并对其用于临床耐药结核病检测的应用价值进行评估。方法 采用MALDI-TOF-MS检测3株国家参考品菌株，测定其对于结核鉴定位点和耐药位点的最低检出限。以非随机抽样法，收集昆明市第三人民医院结核科2023年1月至9月疑似结核病患者呼吸道样本，包括痰液样本120例，肺泡灌洗液样本100例，每例样本含量3～5 mL。供试样本均提取核酸，先用结核荧光定量PCR(quantitative real-time PCR, qPCR)试剂盒筛选出Ct值≤32的结核阳性样本，然后用MALDI-TOF-MS检测与利福平(rifampicin, RIF)、异烟肼(isoniazide, INH)、乙胺丁醇(ethambutol, EMB)、莫西沙星(moxifloxacin, MXF)、链霉素(streptomycin, SM)和吡嗪酰胺(pyrazinamide, PZA)相关的耐药基因位点。同时采用表型药敏法和三代测序(Nanopore平台)对结核阳性样本进行检测并与MALDI-TOF-MS结果进行对比分析，验证其检测耐药结核的准确性。结果 对于结核鉴定位点IS6110和ext＿RD9,MALDI-TOF-MS的最低检出限为60～100 CFU/mL;对于结核耐药位点，MALDI-TOF-MS的最低检出限为100～1 000 CFU/mL。经qPCR法鉴定Ct值≤32的结核阳性标本共132例。对比表型药敏结果，MALDI-TOF-MS检测耐药的敏感度、特异度和kappa值分别是：RIF为93.75%、100%和0.96;INH为98.33%、90.28%和0.88;EMB为83.33%、97.50%和0.78;MXF为95.45%、100%和0.97。与三代测序结果相比，MALDI-TOF-MS检测耐药的敏感度、特异度和kappa值分别是：RIF为90.91%、100%和0.94;INH为92.96%、100%和0.92;EMB为92.86%、100%和0.96;MXF为95.45%、100%和0.97;SM为95.74%、100%和0.97;PZA为66.67%、100%和0.80。结论 MALDI-TOF-MS针对抗结核药物的耐药检测结果与表型药敏和三代测序检测结果对比高度一致，可作为快速检测结核耐药的一种有效方法。

关键词

飞行时间质谱 / 结核分枝杆菌 / 耐药 / 表型药敏 / 三代测序