木犀草素在炎症微环境下调控Wnt/β-catenin信号通路促进骨髓间充质干细胞成软骨分化的机制

摘要

目的 探讨炎症微环境作用下木犀草素对骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）成软骨分化以及对Wnt/β-catenin信号通路的影响。方法 通过网络药理学手段筛选木犀草素调控成软骨分化的基因集，并绘制蛋白质互相作用（protrin-protein interaction, PPI）网络图，随后进行基因本体论（gene ontology, GO）及京都基因与基因组百科全书（kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG）富集分析，筛选成软骨分化相关靶基因与木犀草素进行分子对接处理。采用细胞计数试剂盒-8(cell counting kit-8, CCK8)及细胞增殖试验检测木犀草素对BMSCs的细胞毒性。将大鼠BMSCs分为对照组（使用2mL成软骨分化诱导培养基培养）、模型组[使用2mL含10ng/mL肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor-α, TNF-α）的成软骨分化诱导培养基构建炎症微环境]、低剂量组（在模型组的基础上加入5μmol木犀草素干预）及高剂量组（在模型组的基础上加入10μmol木犀草素干预），诱导各组细胞成软骨分化，构建微团软骨细胞球。对微团软骨细胞球包埋切片后进行组织学（番红-固绿、甲苯胺蓝、阿利新蓝）染色，采用RT-qPCR法检测各组软骨细胞球成软骨基因Ⅱ型胶原蛋白（collagen typeⅡ，COL2）、 Sry相关HMG框转录因子9(sry-box transcription factor9, SOX9)、聚集蛋白聚糖（aggrecan, ACAN）表达量及Wnt/β-catenin信号通路蛋白激酶A (protein kinase A, PKA)、环磷腺苷效应元件结合蛋白（cAMP response element-binding protein, CBP）、糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase3bate,GSK3β)、β-连环蛋白（beta-catenin,β-CATENIN）、细胞髓细胞瘤病毒癌基因同源物（cellular myelocytomatosis viral oncogene homolog, c-MYC）、细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)表达量，采用Western blotting法检测Wnt/β-catenin信号通路蛋白PKA、CBP、GSK3β、β-CATENIN、c-MYC、Cyclin D1表达量。结果 共筛选出木犀草素调控成软骨分化靶基因54个，其中53个参与PPI网络图的构建。靶基因涉及Wnt/β-catenin信号通路正向调控及负向调控等生物过程，木犀草素与Ⅱ型胶原α1蛋白（collagen typeⅡalpha1chain, COL2A1）、SOX9、ACAN均可良好对接。5μmol、10μmol木犀草素无明显细胞毒性。组织学染色显示，模型组软骨细胞球染色比对照组稀疏而且无序，加入木犀草素干预后被明显逆转。与对照组相比，模型组软骨细胞球中COL2、SOX9、ACAN、PKA、CBP、GSK3β、β-CATENIN、c-MC、CYCLIN D1的mRNA表达量明显降低（P<0.05）,GSK3β表达量明显升高（P<0.05）,Wnt/β-catenin信号通路蛋白PKA、CBP、β-CATENIN、c-MYC、CYCLIN D1表达量明显降低（P<0.05）,GSK3β表达量明显升高（P<0.05），加入木犀草素干预后被显著逆转。结论 在炎症微环境下，木犀草素可促进BMSCs成软骨分化，可能与激活Wnt/β-catenin信号通路有关。

关键词

木犀草素 / 骨髓间充质干细胞 / 成软骨分化 / 炎症微环境 / Wnt/β-catenin信号通路