缺氧条件下γ-氨基丁酸能系统对视网膜色素上皮的保护作用

摘要

目的 探讨缺氧条件下γ-氨基丁酸（gama-aminobutyric acid, GABA）能系统在人视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium, RPE）细胞中的作用及其机制，为防治缺氧相关视网膜疾病提供理论依据。方法 分离并培养人RPE细胞，采用RT-PCR法、Western blotting法检测GABA相关分子[谷氨酸脱羧酶65/67 （glutamic acid decarboxylase 65/67, GAD65/67）、γ-氨基丁酸转氨酶（GABA transaminase, GABA-T）、囊泡性GABA转运体（vesicular GABA transporter, VGAT）、GABA转运体1/2 （GABA transporters 1/2, GAT-1/2）]的表达。利用免疫荧光技术检测人RPE细胞及人视网膜组织中GAD67、GABA-T和GAT-2的表达与定位。将RPE细胞暴露于缺氧环境中（1%O₂,37℃,48 h）,检测GAD67、GABA-T和GAT-2表达变化、单层细胞通透性和紧密连接蛋白（zonula occludens-1, ZO-1）水平。将细胞分为常氧空载体对照组、常氧基因过表达组、低氧空载体组以及低氧基因过表达组。通过腺病毒载体分别过表达GAD67、GABA-T或GAT-2,评估其对缺氧诱导的RPE细胞屏障功能损伤的影响。结果 人RPE细胞表达GAD67、GABA-T和GAT-2,但未检测到GAD65、VGAT和GAT-1的表达。与常氧对照组相比，低氧组各基因蛋白GAD67[（17.54±6.89）%,t=2.595,P<0.05]、GABA-T[（18.64±3.56）%,t=3.563,P<0.01]和GAT-2[（31.79±8.49）%,t=4.147,P<0.01]表达显著下调；同时单层RPE细胞的通透性增加[（78.83±34.79）%,t=-3.222,P<0.05], ZO-1水平降低[（22.24±8.31）%,t=3.217,P<0.01]。与低氧空载体对照组相比，低氧过表达GAD67或GABA-T组中升高的RPE细胞通透性减轻了（21.97±11.02）%和（21.40±7.65）%,差异有统计学意义(F_GAD67=14.146,F_GABA-T=35.715,P_GAD67<0.05,P_GABA-T<0.01)。与低氧空载体对照组相比，低氧GAT-2过表达组在无外源GABA添加时未表现出明显保护作用（组间P=0.001,P>0.05,）,但在加入外源GABA后，GAT-2过表达使得缺氧诱导下的RPE细胞通透性下降了（34.49±14.70）%（F=20.084,P<0.01）。此外，GAD67、GABA-T和GAT-2的过表达均未能逆转缺氧导致的ZO-1蛋白降低。结论 人RPE细胞表达GABA能系统。在缺氧条件下，GABA能相关蛋白表达降低并伴随屏障功能损伤。增强GAD67、GABA-T表达可显著改善缺氧诱导的RPE细胞屏障功能异常，GAT-2过表达在补充外源GABA时亦有保护作用，提示GABA能系统可能成为改善缺氧相关视网膜疾病RPE屏障功能的潜在靶点。

关键词

视网膜色素上皮细胞 / γ-氨基丁酸 / γ-氨基丁酸能系统 / 缺氧 / 屏障功能 / 紧密连接蛋白