自噬在APAP肝损伤及肝再生过程中的调控作用

摘要

目的 探究自噬在对乙酰氨基酚（acetaminophen, APAP）诱导的小鼠正常肝细胞（AML-12）肝损伤和肝再生中的作用以及其可能机制。方法 体外培养AML-12细胞，采用Western blotting法检测APAP作用于该细胞0、1、4、12、24、48、72h微管相关蛋白1A/1B轻链3-II（microtubule-associated protein 1A/1B-light chain 3-II, LC3II）蛋白表达，筛选出APAP作用后出现明显肝损伤和肝再生的时间点。一方面使用自噬激动剂雷帕霉素（rapamycin, RAPA）作用于肝损伤点，分为对照组、RAPA组、APAP 4 h组和APAP 4 h+RAPA组，采用Western blotting法检测各组细胞LC3II、自噬相关蛋白5（autophagy related 5, ATG5）、螯合体1（sequestosome 1, p62）、受体相互作用蛋白激酶1（receptor-interacting protein kinase 1, RIP1）、受体相互作用蛋白激酶3（receptor-interacting protein kinase 3, RIP3）、谷胱甘肽过氧化物酶4（glutathione peroxidase 4, GPX4）、溶质载体家族7成员11（solute carrier family 7 member 11, SLC7A11）、p53蛋白水平；采用RT-qPCR法检测各组细胞肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-alpha, TNF-α）、白细胞介素-6（interleukin-6, IL-6）、铁蛋白重链1（ferritin heavy chain 1, FTH1）、核受体辅激活因子4（nuclear receptor coactivator 4, NCOA4）mRNA水平；采用亚铁离子试剂盒检测Fe²⁺水平。另一方面使用自噬抑制剂氯喹（chloroquine, CQ）作用于肝再生点，分为对照组、CQ组、APAP 24 h组和APAP 24 h+CQ组，采用Western blotting法检测各组细胞LC3II、ATG5、p62、增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen, PCNA）、细胞周期蛋白D1（Cyclin D1）蛋白水平；采用RT-qPCR法检测各组细胞Ki-67、yes相关蛋白1（yes-associated protein 1, YAP1）、无翅型MMTV整合位点家族成员2（wingless-type MMTV integration site family member 2, Wnt2）mRNA水平。结果 损伤方面，与对照组相比，APAP 4 h组RIP1、RIP3、p53蛋白水平和TNF-α、IL-6、NCOA4 mRNA、Fe²⁺水平上调（P<0.05）,LC3II、SLC7A11、GPX4蛋白水平和FTH1 mRNA水平下调（P<0.05）;与APAP 4 h组相比，APAP 4 h+RAPA组LC3II、ATG5、SLC7A11、GPX4蛋白水平和FTH1 mRNA水平上调（P<0.05）,p62、RIP1、RIP3、p53蛋白水平和TNF-α、IL-6、NCOA4 mRNA、Fe²⁺水平下调（P<0.05）。再生方面，与对照组相比，APAP 24 h组LC3II蛋白水平和Ki-67、Wnt2、YAP1 mRNA水平上调（P<0.05）,p62、PCNA蛋白水平下调（P<0.05）;与APAP 24 h组相比，APAP 24 h+CQ组LC3II、p62蛋白水平上调（P<0.05）,ATG5、PCNA、Cyclin D1蛋白水平和Ki-67、Wnt2、YAP1 mRNA水平下调（P<0.05）。结论 激活自噬可降低炎症反应、程序性坏死和铁死亡，最终减轻APAP肝损伤；而抑制自噬可能减轻APAP肝损伤后的肝再生过程。自噬激动剂有望成为治疗APAP肝损伤的新靶点。

关键词

自噬 / 铁死亡 / 程序性坏死 / 肝损伤 / 肝再生