RNA结合蛋白ZFP36在心肌细胞缺氧/复氧损伤中的作用及调控机制

摘要

目的 探讨RNA结合锌指蛋白36(ZFP36)在缺氧/复氧(H/R)诱导的心肌细胞损伤和自噬中的作用及分子调控机制。方法 H9C2大鼠心肌细胞感染ZFP36过表达慢病毒(OE-ZFP36)或其阴性对照慢病毒(OE-ZFP36 NC)构建稳转细胞株；转染ATG4D过表达质粒(OE-ATG4D)提高ATG4D表达。H/R处理诱导心肌细胞损伤；将H9C2细胞分为对照组、H/R组、OE-ZFP36 NC+H/R组、OE-ZFP36+H/R组、OE-ATG4D NC+H/R组、OE-ATG4D+H/R组、OE-ZFP36+OE-ATG4D NC+H/R组和OE-ZFP36+OE-ATG4D+H/R组。各组细胞应用Western blotting检测ATG4D、Beclin1、LC3和ZFP36蛋白表达；实时荧光定量PCR(qPCR)检测ZFP36和ATG4D mRNA表达；CCK-8检测细胞活性；酶联免疫吸附法(ELISA)检测白介素6(IL-6)和肿瘤坏死因子(TNF-α)水平；DCFH-DA法检测活性氧(ROS)水平；SOD试剂盒检测SOD水平；流式细胞术检测细胞凋亡；细胞免疫荧光检测LC3自噬体；双荧光素酶报告基因实验检测ZFP36和ATG4D mRNA的结合。结果 与对照组比较，H/R组中细胞活性降低，IL-6和TNF-α水平提高，ROS水平升高而SOD水平降低，细胞凋亡增加；ATG4D、Beclin1蛋白表达上调，同时LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值也显著增加；且ZFP36表达上调(P<0.05)。与OE-ZFP36 NC+H/R组比较，OE-ZFP36+H/R组中细胞活性提高，IL-6和TNF-α水平降低，ROS水平下降而SOD水平升高，细胞凋亡减少，且ATG4D、Beclin1蛋白表达下调，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值也显著下调(P<0.05)。与感染OE-ZFP36 NC慢病毒比较，感染OE-ZFP36慢病毒降低ATG4D 3′-UTR报告基因的荧光素酶活性，降低ATG4D mRNA稳定性，下调H/R诱导的ATG4D mRNA表达(P<0.05)。与OE-ATG4D NC+H/R组相比，OE-ATG4D+H/R组中的ATG4D mRNA和蛋白表达显著上调，且细胞活性降低，IL-6和TNF-α水平增高，ROS水平升高而SOD水平降低，细胞凋亡增加(P<0.05)。与OE-ZFP36+OE-ATG4D NC+H/R组比较，OE-ZFP36+OE-ATG4D+H/R组中细胞活性降低，IL-6和TNF-α水平增高，ROS水平升高而SOD水平降低，细胞凋亡增加(P<0.05)。结论 ZFP36在H/R诱导的心肌细胞损伤中表达上调，过表达ZFP36抑制了H/R诱导的心肌细胞损伤，并通过调控ATG4D抑制自噬，进而抵抗心肌细胞H/R损伤，证明ZFP36是抵抗心肌缺血再灌注损伤的重要调控分子。

关键词

心肌缺血再灌注损伤(MI/RI) / 锌指蛋白36(ZFP36) / 自噬 / 转录后调控 / 自噬相关蛋白4D(ATG4D)

基金资助

汉中市中心医院青年辅助计划资助项目(YK2132)