WTAP介导的ACSL3 m6A修饰抑制铁死亡调节肺癌顺铂耐药的作用机制

摘要

目的 探索酰基辅酶A合成酶长链家族成员3（ACSL3） m6A修饰抑制铁死亡在非小细胞肺癌顺铂耐药中的作用及机制。方法 在体外培养的人肺腺癌耐顺铂株A549/DDP细胞中，分别通过感染ACSL3短发夹RNA慢病毒载体、转染Wilms肿瘤1相关蛋白（WTAP）小干扰RNA（siRNA）质粒、或共转染WTAP siRNA质粒与ACSL3过表达质粒并进行干预。处理48 h后，更换含1μg/m L顺铂的完全培养基继续培养24 h。ACSL3短发夹RNA慢病毒载体感染的A549（或A549/DDP）细胞接种至裸鼠背部皮下以构建皮下荷瘤模型。免疫荧光染色检测顺铂处理（或正常培养）的A549和A549/DDP细胞的ACSL3蛋白表达，细胞克隆形成实验检测细胞顺铂敏感性，铁橙（Ferro Orange）染色和总铁离子检测试剂盒检测细胞或组织中铁离子含量。BODIPY 581/591 C11染色检测细胞脂质过氧化水平。MeRIPq PCR实验检测ACSL3的m6A甲基化修饰。RNA衰变实验检测细胞中ACSL3的mRNA稳定性。qRT-PCR和Western blotting分别检测ACSL3和WTAP的mRNA和蛋白表达。免疫组化检测铁蛋白（Ferritin）及COX2的表达。结果 顺铂处理后，ACSL3在A549/DDP细胞中蛋白表达的下降幅度[（48.70±3.81）%]显著低于A549细胞[（65.62±2.53）%]。ACSL3敲低显著降低A549/DDP细胞克隆能力，增强了Ferro Orange染色强度、总铁离子和脂质过氧化物水平（P<0.05）。顺铂处理后A549/DDP细胞的ACSL3 m6A修饰水平降低，且其下降幅度显著低于A549细胞（P<0.05）。WTAP敲低显著增强ACSL3衰减速率，降低ACSL3 m6A富集率。与仅敲低WTAP的A549/DDP细胞相比，同时敲低si-WTAP并过表达ACSL3的细胞克隆能力显著升高，Fe²⁺含量、总铁离子水平、脂质过氧化水平均降低。裸鼠皮下荷瘤实验证实，ACSL3敲低可上调荷瘤组织COX2水平、Ferritin水平、铁离子和活性氧水平，并抑制移植瘤生长。结论WTAP通过介导ACSL3 mRNA的m6A修饰抑制铁死亡，降低A549细胞的顺铂敏感性，进而调控肺癌的进展。

关键词

肺癌 / 铁死亡 / 顺铂耐药 / 酰基辅酶A合成酶长链家族成员3 (ACSL3) / Wilms肿瘤1相关蛋白(WTAP)