微小RNA-199a-3p对小鼠皮肤瘢痕疙瘩成纤维细胞的抑制作用及其机制

摘要

目的 探讨微小RNA-199a-3p(miR-199a-3p)对小鼠皮肤瘢痕疙瘩成纤维细胞的调控作用及其作用靶基因。方法 构建小鼠皮肤瘢痕疙瘩模型，采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测miR-199a-3p、瘢痕疙瘩相关基因和Smad1的mRNA表达。原代分离和体外培养成体C57BL/6小鼠皮肤成纤维细胞；利用脂质体将miR-199a-3p模拟物和Smad1 siRNA转染至小鼠皮肤成纤维细胞中；双荧光素酶报告实验验证miR-199a-3p的靶基因；Cell Counting Kit-8(CCK8)方法验证miR-199a-3p和沉默Smad1对皮肤成纤维细胞增殖的影响；RT-qPCR和Western blot法分别检测过表达miR-199a-3p皮肤成纤维细胞的瘢痕疙瘩相关基因和Smad1的mRNA和蛋白表达；Western blot检测小鼠皮肤成纤维细胞分别转染Smad1 siRNA和miR-199a-3p模拟物后瘢痕疙瘩相关基因、Smad1的蛋白表达。结果 疤痕疙瘩组织中瘢痕疙瘩相关基因Col1a1(t=-3.334,P=0.016)、Col3a1(t=-5.927,P=0.001)和ACTA2(t=-3.673,P=0.010)mRNA表达和Smad1(t=-4.403,P=0.010)表达显著高于正常小鼠皮肤组织，而miR-199a-3p(t=7.059,P<0.001)表达显著下降。在皮肤成纤维细胞中过表达miR-199a-3p可以抑制瘢痕疙瘩的相关基因Col1a1(t=5.514,P=0.005)、Col3a1(t=5.132,P=0.014)和ACTA2(t=4.136,P=0.026)mRNA表达和相关蛋白Col1a1(t=4.643,P=0.001)、Col3a1(t=6.554,P=0.003)和α-SMA(t=4.681,P=0.008)表达。miR-199a-3p与Smad1 3′-UTR有结合作用。过表达miR-199a-3p抑制Smad1 mRNA(t=3.556,P=0.024)和蛋白(t=3.781,P=0.019)的表达。分别转染miR-199a-3p模拟物和Smad1 siRNA后均能同时抑制小鼠皮肤成纤维细胞的增殖(F=18.622,P<0.001、<0.001)和瘢痕疙瘩的相关蛋白Col1a1(F=18.804,P=0.003、0.022)、Col3a1(F=33.212,P=0.001、0.001)和α-SMA(F=10.181,P=0.020、0.028)表达。结论 miR-199a-3p通过靶向Smad1抑制瘢痕疙瘩的形成。

关键词

皮肤瘢痕疙瘩 / 皮肤成纤维细胞 / 微小RNA / Smad1

基金资助

广东省中医药局科研项目(No.20241368); 广东省普通高校青年创新人才类项目(No.2023KQNCX252)