FC8衍生肽对临床多重耐药菌的抗菌效应及作用机制

摘要

目的 通过赖氨酸替换策略设计抗菌肽FC8的衍生肽，并探讨其对临床耐药菌的作用机制。方法 采用位点突变法将抗菌肽FC8中第7、10、21位的谷氨酰胺残基分别替换为赖氨酸，构建系列FC8衍生肽。通过圆二色光谱（circular dichroism, CD）检测肽的二级结构；采用微量肉汤稀释法测定最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration, MIC）;利用CCK-8法评估其对BESA-2B细胞的细胞毒性。通过N-苯基-1-萘胺（N-phenyl-1-naphthylamine, NPN）荧光探针实验与脂质体模型实验分析肽与细胞膜的作用机制，并以凝胶阻滞分析评估肽与细菌基因组DNA的结合能力。结果 CD光谱结果显示，FC8及其衍生肽在磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline, PBS）中为无规卷曲结构，而在50%三氟乙醇环境中呈现α-螺旋结构。抗耐药鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii）方面，FC8、Q10K、Q7K/Q10K与Q7K/Q10K/Q21K肽的几何平均MIC值（geometric mean MIC, GM）分别为6.5、4.9、4.5、3.7μmol/L;抗耐药金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的GM值分别为4.0、2.6、2.5、2.0μmol/L。各衍生肽对BESA-2B细胞的半数抑制浓度(half maximal inhibitory concentration, IC₅₀)分别为120.9、118.2、103.9、80.5μmol/L。治疗指数（therapeutic index, TI）计算结果显示，Q10K衍生肽的TI最高。NPN荧光探针实验与脂质体模型实验结果提示，FC8及其衍生肽可有效破坏耐药菌细胞膜；凝胶阻滞分析显示，FC8及其衍生肽与细菌基因组DNA结合能力显著。结论 适度增加FC8肽的正电荷有助于增强其膜靶向性以及与DNA结合能力，从而显著提高其抗菌活性和TI。FC8衍生肽通过破坏细胞膜和结合细菌DNA的双重靶点机制，实现对临床耐药菌的有效杀菌作用。

关键词

抗菌肽 / FC8 / 鲍曼不动杆菌 / 金黄色葡萄球菌 / α-螺旋 / 荧光光谱 / 凝胶阻滞分析 / 多重耐药菌

基金资助

黑龙江省卫生健康委课题项目(No.20210202020363)