miR-93靶向MFN2调节线粒体相关内质网膜动态平衡影响ARDS肺纤维化的机制研究

摘要

目的 聚焦miR-93与线粒体融合蛋白2(MFN2)的调控关系，探讨其通过调节内质网应激(ERS)和线粒体功能对急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome, ARDS)肺纤维化的影响。方法 通过脂多糖(LPS)诱导人胚肺成纤维细胞(HFL-1)构建ARDS肺纤维化细胞模型，结合miR-93抑制剂与MFN2干扰质粒(si-MFN2)进行功能验证及机制研究，分为inhibitor NC组(转染inhibitor NC)、miR-93 inhibitor组(转染miR-93 inhibitor)、miR-93 inhibitor+si-NC组(转染miR-93 inhibitor和si-NC)和miR-93 inhibitor+si-MFN2组(转染miR-93 inhibitor和si-MFN2);ELISA及Western blot检测细胞上清中的Ⅰ型胶原蛋白(collagenⅠ,COLⅠ)含量；qRT-PCR检测miRNAs及MFN2表达；CCK-8实验检测细胞活力；流式细胞术检测细胞凋亡；Western blot检测内质网应激相关蛋白(Bip/GRP78、IRE1)及线粒体自噬相关蛋白(Beclin-1)的表达水平；双荧光素酶报告基因检测miR-93与MFN2的靶向调控关系。结果 予以LPS诱导人胚肺成纤维细胞，LPS组COLⅠ含量较对照组明显增加(P<0.01),提示ARDS肺纤维化体外细胞模型构建成功；miR-93 inhibitor组较inhibitor NC组MFN2表达显著上调，且HFL-1细胞增殖活性下降、细胞凋亡率增加，肺组织纤维化标志物COLⅠ分泌减少(均P<0.01);双荧光素酶报告基因实验证明了miR-93与MFN2靶向结合；此外，miR-93 inhibitor组较inhibitor NC组ERS标志物(Bip/GRP78、IRE1)表达下调，线粒体自噬相关蛋白(Beclin-1)的表达上调(均P<0.01);同时转染miR-93 inhibitor及干扰MFN2后可抑制这种效应，与miR-93 inhibitor组比较，miR-93 inhibitor+si-MFN2组细胞增殖活性抑制作用减弱，COLⅠ分泌增加，且ERS标志物(Bip/GRP78、IRE1)表达上调，线粒体自噬相关蛋白(Beclin-1)表达下调。结论 抑制miR-93通过靶向上调MFN2表达，维持线粒体相关内质网膜(mitochondria-associated endoplasmic reticulum membrane, MAM)动态平衡，抑制ERS并促进线粒体自噬，最终减轻ARDS肺纤维化进程。

关键词

ARDS肺纤维化 / miR-93 / MFN2 / 内质网应激