XBP1 m6A去甲基化修饰在姜黄素诱导Huh7肝癌细胞凋亡中的作用机制

摘要

目的 探讨脂肪量和肥胖相关蛋白(obesity-associated protein, FTO)介导的X-框结合蛋白1(X-box binding protein 1,XBP1)N6腺苷酸甲基化(N6-methyladenosine, m6A)去甲基化修饰在姜黄素诱导的Huh7肝癌细胞凋亡中的作用及机制。方法 (1)采用不同浓度(0、5、10、20、40、60μmol/L)姜黄素处理Huh7细胞48 h, CCK-8检测细胞存活率；流式细胞术检测细胞凋亡水平；Western blot检测细胞中FTO、XBP1及凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、cleaved Caspase-3表达水平；甲基化RNA免疫共沉淀法检测各组细胞中XBP1 RNA m6A甲基化水平。(2)将FTO干扰片段(si-FTO)及其阴性对照(si-NC)、FTO过表达质粒(oe-FTO)及其阴性对照(Vector)转染至Huh7细胞中，再联合20μmol/L姜黄素或160μmol/L甲基化抑制剂3-脱氮腺苷(3-deazaadenosine, 3-DAA)处理48 h, qRT-PCR法检测细胞中FTO和XBP1 mRNA表达水平；流式细胞术检测细胞凋亡水平；甲基化RNA免疫共沉淀法检测细胞中XBP1 RNA m6A甲基化水平；放线菌素D实验检测细胞XBP1 mRNA半衰期；Western blot检测细胞中FTO、XBP1、cleaved Caspase-3等蛋白表达水平。结果 不同浓度姜黄素干预可显著抑制Huh7细胞存活，诱导细胞凋亡(均P<0.05);同时，上调细胞中Bax、cleaved Caspase-3蛋白表达水平和XBP1 RNA m6A甲基化水平，下调Bcl-2、FTO和XBP1蛋白表达水平(均P<0.05)。沉默FTO基因可诱导Huh7细胞凋亡，提高细胞中XBP1 RNA m6A甲基化水平，缩短XBP1 mRNA半衰期，下调XBP1 mRNA和蛋白表达水平(均P<0.05)。然而，3-DAA干预显著逆转FTO基因沉默介导XBP1 mRNA m6A修饰诱导的Huh7细胞凋亡；同时，过表达FTO显著逆转姜黄素对Huh7细胞凋亡的诱导作用。结论 姜黄素可通过下调FTO表达，抑制XBP1 m6A去甲基化，进而促进XBP1 mRNA和蛋白降解，诱导肝癌细胞凋亡。

关键词

肝癌 / 姜黄素 / 甲基化 / 脂肪量和肥胖相关蛋白 / X-框结合蛋白1 / 凋亡

基金资助

湖南省自然科学基金项目(No.2024JJ7465); 湖南省教育厅重点项目(No.23A0348); 湖南省卫生健康委重点指导项目(No.202104010743); 湖南省科技厅重点研发项目(No.2020SKC2009)