mTORC1通过β-TrCP调控TPP1蛋白的稳定性

摘要

目的 探讨雷帕霉素机制性靶蛋白复合物1(mechanistic target of rapamycin complex 1,mTORC1)通过β-转导素重复序列蛋白(β-TrCP)对三肽基肽酶1(tripeptidyl peptidase 1,TPP1)蛋白稳定性的调控作用。方法 利用免疫共沉淀、谷胱甘肽巯基转移酶沉降技术(GST Pull-down)以及蛋白质免疫印迹技术(Western blot)探究TPP1与mTORC1和(或)β-TrCP之间的相互作用；利用不同营养应激或雷帕霉素调节体外培养细胞的mTORC1活性，通过Western blot观察TPP1蛋白表达水平，或通过定量聚合酶链式反应(quantitative real-time PCR,qPCR)观察TPP1转录水平；利用蛋白酶体或Cullin neddylation抑制剂探究TPP1蛋白降解是否由蛋白酶体和Cullin依赖性的E3泛素连接酶介导；利用DNA点突变(site-directed DNA mutagenesis)技术将TPP1上潜在的β-TrCP识别的磷酸化降解决定子(phosphodegron)序列中的丝氨酸(S)突变为丙氨酸(A);利用慢病毒介导的shRNA技术静默β-TrCP或Cullin1基因的表达；利用Western blot检测TPP1磷酸化以及泛素化水平，并验证Phosphodegron中的两个丝氨酸位点对其泛素化的重要性；利用体外TPP1活性实验探究Phosphodegron突变是否会影响TPP1活性。结果 TPP1与mTORC1或β-TrCP均存在相互作用；TPP1蛋白水平与mTORC1活性成反比，且蛋白水平的变化并非由转录水平改变引起；蛋白酶体被抑制或β-TrCP被敲低后，TPP1蛋白水平升高。体外激酶实验表明TPP1可以被mTORC1磷酸化，体内泛素化实验表明TPP1可以被β-TrCP泛素化；TPP1的Phosphodegron突变不会影响TPP1活性。结论 mTORC1通过磷酸化TPP1促进其与β-TrCP的特异性结合，进而导致TPP1的泛素化以及蛋白酶体降解。

关键词

mTORC1 / β-TrCP / TPP1 / 泛素-蛋白酶体系统