催乳颗粒通过分泌Frizzled相关蛋白2-Wnt/β-catenin信号通路改善大鼠产后缺乳

摘要

目的 基于分泌Frizzled相关蛋白2(secreted frizzled-related protein 2, SFRP2)-Wnt/β-catenin信号通路探讨催乳颗粒（Cuiru Keli, CRKL）治疗产后缺乳的效果及其作用机制。方法 通过向分娩后第3天的雌鼠灌胃2 mL1.6 mg/mL甲磺酸溴隐亭来建立产后缺乳大鼠模型。将产仔时间差小于48 h的雌性大鼠随机分为7组：正常组（不造模，不给药）；模型组；CRKL低剂量组（模型组+3 g/kg CRKL）;CRKL中剂量组（模型组+6 g/kg CRKL）、CRKL高剂量组（模型组+9 g/kg CRKL）；阳性药组（模型组+3 mg/kg多潘立酮）；NC组（模型组+生理盐水）；每组6只。除正常组和模型组外，其余5组按分组药物和剂量连续灌胃给药，每天1次，共10 d。取7组大鼠，测量10 d仔鼠总窝质量变化、HE染色观察乳腺病理变化。取除阳性对照组之外的6组大鼠，HE染色观察垂体病理变化，检测血清中PRL含量（ELISA）、乳腺组织（mammary tissue, MT）中PRLR的表达（免疫组化染色）、MT中乳汁合成相关基因mRNA的表达（RT-qPCR），然后以网络药理学和分子对接研究CRKL对产后缺乳的治疗作用和机制，特别是其是否通过SFRP2-Wnt/β-catenin信号通路治疗产后缺乳；再通过检测相关通路基因（RT-qPCR）和蛋白（Western blot）进行验证。然后进行细胞实验验证：取鉴定后的大鼠乳腺上皮细胞（rat mammary epithelial cell, RMEC），将RMEC分为4组：正常组（原代培养的RMEC，不处理）、 SFRP2过表达组（原代培养的RMEC+SFRP2过表达载体）、 SFRP2过表达+CRKL组（SFRP2过表达组+10%含药血清）、阴性对照组（原代培养的RMEC+空载体）。RT-qPCR检测过表达SFRP2后CRKL对于乳汁合成相关基因FASN、CSN2和GLUT1 mRNA表达的影响。结果 与模型组相比，低、中、高剂量的CRKL均可以提高仔鼠10 d体质量增加量（P<0.05或P<0.01），均能有效增加产后缺乳大鼠泌乳量（P<0.01），增加乳腺小叶的面积，增加腺泡腔的大小和填充量，并促进产后缺乳大鼠催乳素的分泌和表达（P<0.05或P<0.01），显著促进产后缺乳大鼠乳腺乳脂、乳蛋白和乳糖合成基因的表达（P<0.05或P<0.01）。网络药理学表明，Wnt信号通路可能是CRKL治疗产后缺乳的关键通路。分子对接结果表明CRKL和CCND1、SFRP2具有良好的结合能力。与模型组相比，低、中、高剂量的CRKL均抑制体内SFRP2基因的表达（P<0.01），激活了产后缺乳大鼠乳腺中的Wnt/β-catenin信号通路中CCND1、c-Myc的基因和蛋白的表达（P<0.05或P<0.01）。细胞实验表明，过表达SFRP2后，与正常组相比，乳汁合成相关基因FASN、CSN2和GLUT1的mRNA水平也降低（P<0.01）。加入含药血清后，上述基因的表达上调（与SFRP2过表达组相比，P<0.01）。结论 CRKL通过SFRP2-Wnt/β-catenin信号通路治疗产后缺乳，SFRP2可能成为产后缺乳诊断和治疗的新靶点。这揭示了CRKL治疗产后缺乳的新机制，并促进了其临床推广。

关键词

催乳颗粒 / 产后缺乳大鼠模型 / 网络药理 / 乳腺上皮细胞 / 作用机制 / 中医药

基金资助

安徽省科技厅科研项目（No.2022e07020028、No.1804a0802218）;; 安徽省教育厅科研项目（No.KJ2021A0588、No.gxgwfx2022019）;; 安徽中医药大学科研项目（No.2020rcZD001、No.2022BHTNXA05）资助