范科尼贫血通路FANCM基因纯合突变导致早发性卵巢功能不全的致病机制

摘要

目的 探究范科尼贫血（Fanconi anemia, FA）通路中的FANCM(FA complementation group M)基因及其突变在早发性卵巢功能不全（premature ovarian insufficiency, POI）发生中的致病机制。方法 对1例POI患者进行了全外显子组测序，并通过Sanger测序对突变位点进行验证。构建含有野生型和突变型FANCM基因的质粒，分别转染至293T细胞中，转染野生型人类FANCM质粒、突变型人类FANCM质粒、pEGFP-C1空载体质粒的293T细胞分别命名为EGFP FANCM-WT组、EGFP FANCM-MUT组和EGFP组。对于截短蛋白的验证，3组质粒转染48 h后提取细胞蛋白，使用GFP抗体进行验证。对于DNA损伤修复影响的研究，免疫荧光实验在EGFP FANCM-WT组、EGFP FANCM-MUT组293T细胞质粒转染48 h后进行，以研究该突变是否会影响FANCM定位于染色质的能力；利用丝裂霉素C(mitomycin C, MMC)在体外诱导EGFP FANCM-WT组、EGFP FANCM-MUT组293T细胞链间交联（interstrand crosslinks, ICLs）损伤的形成，然后使用γ-H2AX抗体验证其对ICLs损伤修复的影响。结果 在1例近亲婚配家系的POI患者中，我们发现了FANCM基因c.1152-1155del:p.Leu386Valfs*10的纯合突变。Western blot结果表明，该突变导致截短的FANCM蛋白产生。在丝裂霉素C处理后，与EGFP FANCM-WT组相比，EGFP FANCM-MUT组293T细胞中γ-H2AX水平升高（P<0.01）。免疫荧光结果提示，突变FANCM蛋白的细胞定位只存在于细胞质，在细胞核中缺失，突变的FANCM定位于染色质的能力受损。结论 FANCM基因c.1152-1155del:p.Leu386Valfs*10纯合突变导致截短的FANCM蛋白产生，并且影响FANCM蛋白在细胞核的定位，抑制其应对DNA损伤修复的能力，从而引起女性不孕。

关键词

FANCM基因 / 突变 / 早发性卵巢功能不全 / DNA损伤