流体剪切力调控血脑屏障的力学生物学机制研究

摘要

目的 血脑屏障（blood-brain barrier, BBB）主要由脑微血管内皮细胞组成。本研究以大鼠脑微血管内皮细胞（rat brain microvascular endothelial cells, rBMECs）为模式细胞，探索正常生理、缺血低灌注和术后高灌注条件下的流体剪切力（flow shear force, FSF）对BBB结构功能的保护、损伤和破坏的力学生物学机制。方法 以1×10～5细胞/cm²的密度接种rBMECs培养48 h，对rBMECs分别施加0.5、2和20 dyn/cm2的FSF，模拟脑血管狭窄的低灌注、正常生理和搭桥术后高剪切力作用下BBB结构的受力情况；同时设置静态培养组rBMECs作为对照（不施加力）。光学显微镜、扫描电子显微镜（SEM）以及激光共聚焦显微镜（LSCM）观察细胞形态和骨架的变化。透射电子显微镜（TEM）观察细胞紧密连接，免疫荧光染色检测紧密连接相关蛋白（claudin-5、occludin、ZO-1）、黏着连接相关蛋白（VE-cadherin、PECAM-1）分布的变化。Western blot检测不同强度FSF下紧密连接相关蛋白（claudin-5、ZO-1、JAM4），黏着连接相关蛋白（VE-cadherin）和Rho GTPases信号关键蛋白（Rac1、Cdc42、RhoA）的表达。结果 镜下观察发现：静态培养和低剪切作用（0.5 dyn/cm²）下细胞骨架排列紊乱，取向无规律；正常生理剪切作用（2 dyn/cm²）下，细胞骨架顺应FSF方向重排，胞间观察到有效的紧密连接结构；高剪切作用（20 dyn/cm²）下，细胞间间隙增大，未观察到有效的紧密连接结构。免疫荧光染色发现低剪切作用时，细胞间距减小，但胞间连接处紧密连接相关蛋白和黏着连接相关蛋白分布较少；正常生理条件下细胞连接紧密，大部分紧密连接相关蛋白的分布集中在胞间连接处；高剪切作用时，胞间距离显著增大，连接紧密和黏着连接的结构被破坏。Western blot结果发现：低剪切作用下，claudin-5、ZO-1和VE-cadherin与对照组相比均上调（P<0.05）；正常生理剪切作用下，claudin-5、ZO-1、JAM4以及VE-cadherin与对照组相比均呈现高表达（P<0.05）；高剪切作用下，claudin-5、ZO-1、JAM4以及VEcadherin的表达与正常生理剪切作用组比较下调（P<0.05）；生理条件下胞内的Rho GTPases（Rac1、Cdc42、RhoA）表达上调，高于其他实验组（P<0.05），而低剪切和高剪切作用下的Rho GTPases表达均较正常生理剪切作用组下调（P<0.05）。结论 正常生理条件下的FSF有助于维持BBB结构的完整性，而低剪切或高剪切均会损伤或破坏血脑屏障的结构，FSF对BBB的调控与紧密连接相关蛋白和黏着连接相关蛋白的表达和分布密切相关。

关键词

血脑屏障 / 流体剪切力 / 大鼠脑微血管内皮细胞 / 紧密连接相关蛋白 / 黏着连接相关蛋白