程氏蠲痹汤通过阻断WTAP-Wnt7b-Wnt/β-catenin信号轴抑制类风湿性关节炎病理

摘要

目的 采用胶原诱导的关节炎（collagen-induced arthritis, CIA）小鼠和类风湿关节炎（rheumatoid arthritis,RA）患者的成纤维样滑膜细胞（fibroblast-like synoviocytes, FLSs）研究程氏蠲痹汤（CSJBD）的抗RA作用，并探讨其作用机制。方法 体内实验：实验动物为体质量17～20 g的雄性C57BL/6小鼠，构建CIA模型。将小鼠分为正常组、模型组（CIA）、模型+CSJBD-L组（8.1 g/kg）、模型+CSJBD-M组（16.2 g/kg）、模型+CSJBD-H组（32.4 g/kg）和模型+来氟米特（LEF）组（0.05 mg/10 g），每组10只。CSJBD每天灌胃两次，LEF每天灌胃一次，持续28 d。体外实验：将RA FLSs分为RA FLSs组、RA FLSs+CSJBDS-L组（10%含药血清）、RA FLSs+CSJBDS-M组（15%含药血清）、RA FLSs+CSJBDS-H组（20%含药血清）和RA FLSs+NC组（阴性对照）。在观察肾母细胞瘤1相关蛋白（Wilms tumor 1 associated protein, WTAP）是否调控Wnt7b研究中，将RA FLSs分为RA FLSs组、RA FLSs+si-WTAP#3组、RA FLSs+si-WTAP#3+Wnt7b-OE组和RA FLSs+si-WTAP#3+Wnt7b-NC组。在研究CSJBT影响RA FLSs机制中，将RA FLSs分为RA FLSs组、RA FLSs+CSJBDSM组、RA FLSs+CSJBDS-M+Wnt7b-OE组和RA FLSs+CSJBDS-M+NC组。采用超高效液相色谱法（ultra-high performance liquid chromatography, UPLC）测定CSJBD部分单体化合物作为CSJBD制备的质量标准，采用生物信息学、CCK-8、RTqPCR、Western blot、免疫荧光等方法研究CSJBD治疗RA的疗效和机制。结果 UPLC检测显示，阿魏酸、蛇床子素、桑皮苷A、羌活醇和龙胆苦苷是制备CSJBD的质量控制标准品。CSJBD改善了CIA小鼠的RA病理，降低了血清中白细胞介素（interleukin, IL）-6 、 IL-1β 、 IL-8和肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α, TNF-α)的水平，降低了RA病理基因MMP3和Fibronectin的表达。生物信息学预测CSJBD可能通过Wnt7b抑制Wnt/β-catenin信号通路来抑制RA病理。实验结果表明，WTAP和Wnt7b的表达在RA中显著增加。敲低WTAP后，Wnt7b的表达显著降低，Wnt/β-catenin信号通路也受到抑制，组间差异有统计学意义（P<0.05），证实WTAP通过调控Wnt7b发挥作用。通过实验验证，CSJBD显著抑制Wnt/β-catenin信号通路和RA FLSs增殖，Wnt7b-OE可逆转CSJBD对Wnt/β-catenin信号通路和RA FLSs增殖的抑制作用，证实Wnt7b是CSJBD的直接靶标。结论 CSJBD通过阻断WTAP-Wnt7b-Wnt/β-catenin信号轴抑制RA病理，Wnt7b是CSJBD的直接靶点。

关键词

类风湿性关节炎 / 程氏蠲痹汤 / WTAP / Wnt7b / Wnt/β-catenin信号通路