不同秀丽隐杆线虫U6启动子对CRISPR/Cas9介导的基因编辑效率的影响

摘要

目的 本研究拟以秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans,C.elegans）为模型,探究其内源性U6启动子对dpy-10基因编辑效率的影响。方法 利用WormBase数据库筛选C.elegans内源性U6 snRNA基因;通过分子克隆技术,以pSX524质粒(P_eft-3:Cas9::tbb-2 terminator::U6_r07e5.16::dpy-10 sgRNA)为模板,替代其U6_r07e5.16启动子,以构建其他14种靶向dpy-10基因的打靶载体;采用标准化微注射流程,对野生型C.elegans进行基因编辑,基于其子1代线虫dpy-10基因突变表型的筛选,计算基因编辑效率和高效基因编辑指数这两个观测指标。结果 从WormBase数据库获得15个U6 snRNA基因（r07e5.16、f35c11.9、t20d3.13、k09b11.15、k09b11.16、w05b2.8、c28a5.7、f54c8.9、k09b11.11、k09b11.12、k09b11.14、t20d3.12、f54c8.8、f54c8.10、k09b11.13）。基于基因编辑效率和高效基因编辑指数对这些基因启动子活性进行评估后,发现4个U6基因（w05b2.8、c28a5.7、f54c8.9、k09b11.11）启动子能显著提高基因编辑的成功率,其表现优于其他启动子,包括C.elegans研究中广泛使用的U6_r07e5.16和U6_k09b11.12启动子。此外,在使用高效U6_w95v2.8启动子的情况下,gRNA^F+E支架相较于gRNA支架并未表现出更高的编辑效率。结论 本研究鉴定了能显著提高C.elegans基因编辑效率的U6启动子,揭示了U6启动子优化选择在基因编辑系统中的关键作用,为改进基因组编辑策略提供了重要依据,并为优化线虫研究中的CRISPR技术提供了新思路。

关键词

秀丽隐杆线虫 / U6启动子 / CRISPR/Cas9 / 基因编辑 / 效率