从2^-ΔΔC_T法到2^-C_T法：一种更严谨的RT-qPCR数据分析策略

摘要

目的 本研究旨在通过数学原理优化RT-qPCR数据分析流程,用更严谨的2^-C_T法替代存在偏差的2^-ΔΔC_T法,提升基因表达定量研究的准确性。方法 本质上C_T值在比较C_T法的计算逻辑里是2的指数。传统2^-ΔΔC_T法在计算过程中直接对C_T值和ΔC_T取算术平均值,忽略了C_T值的指数特性,导致计算结果存在偏差。我们提出新的“2^-C_T法”,其核心是基于C_T值做2^-C_T变换后再进行所有计算,包括计算各样品内目的基因和内参基因的相对起始表达量、目的基因相对含量、目的基因相对变化倍数,最后基于目的基因相对变化倍数进行统计学分析。该方法严格遵循C_T值的指数特性,避免了C_T和ΔC_T层面算术平均引入的偏差。本研究利用不同RT-qPCR数据,评估了传统2^-ΔΔC_T法和新2^-C_T法在基因表达定量分析中的差异及其影响。结果 两种方法在LIVAK和SCHMITTGEN原始数据中的计算结果差异较小。但在镉暴露实验中,2^-ΔΔC_T法计算结果显示8 h镉暴露可使秀丽隐杆线虫的irg-6基因表达水平从1.314倍增加到7.125倍（P=0.0002）,而2^-C_T法计算结果显示irg-6基因表达水平从1倍增加到4.124倍（P=0.001 5）。两种计算方法的变化倍数相差达70%。结论 2^-C_T法在数学逻辑上更严谨,能更准确地反映基因表达变化,尤其适用于C_T值变异较大的实验数据,这为基因表达定量分析提供了更可靠的计算范式。

关键词

RT-qPCR / 数据分析 / 2^-ΔΔC＿T / 2^-C＿T / 基因表达定量 / 秀丽隐杆线虫 / 镉 / irg-6