中性粒细胞微囊泡调控人滑膜成纤维细胞LINE1基因甲基化

摘要

目的 研究中性粒细胞微囊泡（neutrophil-derived microvesicles, NDMV）通过调控DNA甲基转移酶（DNA methyltransferases, DNMT）促进成纤维样滑膜细胞（fibroblast-like synoviocytes, FLS，或称滑膜成纤维细胞）LINE1基因高甲基化。方法 分离健康志愿者外周静脉血中的中性粒细胞并用肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α, TNFα)刺激其产生NDMV。原代培养FLS至第4代备用。MTT实验检测NDMV处理FLS适宜比和时间。实验分为对照组、TNFα组、NDMV组和TNFα+NDMV组，采用硫酸氢钠联合限制性内切酶分析法（combined bisulfite restriction analysis, COBRA）检测整体和两个位点LINE1基因甲基化程度，运用RT-qPCR和Western blot检测各组磷酸化和非磷酸化DNA甲基转移酶1(DNMT1)的表达水平。结果 NDMV∶FLS≤100∶1时无明显细胞毒性（P>0.05）。NDMV处理FLS 24 h内对细胞活性无明显影响（P>0.05）。TNFα组LINE1基因整体甲基化程度为（37.62±2.38）%，与对照组（58.97±1.50）%、NDMV组（59.59±1.15）%和TNFα+NDMV组（59.11±0.85）%间差异均有统计学意义（P<0.001）；对照组、NDMV组和TNFα+NDMV组LINE1基因位点1和2甲基化程度分别与TNFα组比较差异亦均有统计学意义（P<0.01）。对照组、TNFα组、NDMV组和TNFα+NDMV组磷酸化DNMT1蛋白相对表达量分别为1.00±0.01、0.40±0.01、2.18±0.02和1.58±0.05(P<0.001)。结论 NDMV通过调控FLS的磷酸化DNMT1表达提高LINE1基因甲基化程度。

关键词

类风湿关节炎 / 中性粒细胞微囊泡 / 滑膜成纤维细胞 / DNA甲基转移酶