乌头酸脱羧酶1通过衣康酸-自噬轴促进肝细胞癌生长的机制研究

摘要

目的 探讨乌头酸脱羧酶1(aconitate decarboxylase 1,ACOD1)在肝细胞癌中的表达水平及其对肝癌细胞生长的作用与相关机制。方法 基于GTEx与TCGA数据库分析ACOD1基因在肝癌中的表达及其与患者生存的关系,采用免疫印迹法检测4对肝癌及癌旁组织中ACOD1的蛋白表达。在肝癌细胞HepG2和PLC/PRF/5中敲低ACOD1基因后,通过MTT与LDH实验分别检测细胞增殖与死亡情况。在敲低ACOD1基因的同时给予4-辛基衣康酸(4-octyl itaconate,4-O1),观察细胞增殖变化。利用cBioPortal数据库通过KEGG富集分析预测潜在机制,并采用免疫印迹检测自噬相关蛋白LC3-Ⅱ与p62的表达;进一步在敲低ACOD1基因后联合氯喹(chloroquine,CQ)处理或回补4-OI,观察自噬标志蛋白变化及细胞增殖情况。结果 ACOD1在肝癌组织中的蛋白表达显著高于癌旁组织(约2倍),且高表达患者总生存期较短(P<0.05)。在ACOD1高表达的HepG2和PLC/PRF/5细胞中,敲低ACOD1基因可抑制HepG2细胞(降低约20%)和PLC/PRF/5细胞(降低约30%)增殖(均P<0.05),并提高细胞死亡率(均上升约30%,均P<0.05)。4-OI以浓度依赖方式促进细胞生长,并能逆转敲低ACOD1基因导致的细胞活力下降,分别恢复至对照组的93%和90%(均P<0.05)。KEGG分析提示ACOD1可能与自噬通路相关;敲低ACOD1基因后,HepG2和PLC/PRF/5细胞中LC3-Ⅱ水平显著上升(分别约7倍和10倍,均P<0.05),而p62水平下降(分别40%和30%,均P<0.05);CQ处理后,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比例和p62蛋白表达水平均增加2倍(P<0.05),而联合敲低ACOD1基因可进一步增加LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比例(约10%,P<0.05),且p62蛋白表达水平未见明显增加(P>0.05)。回补4-OI可逆转敲低ACOD1基因引起的LC3-Ⅱ和p62蛋白表达水平变化;同时,CQ处理也能部分挽救敲低ACOD1基因所致的HepG2和PLC/PRF/5细胞活力下降(分别恢复至75%和80%,均P<0.05)。结论 ACOD1在肝癌中高表达且与不良预后相关;其通过合成衣康酸抑制细胞自噬,从而促进肝癌细胞生长。

关键词

肝细胞癌 / 乌头酸脱羧酶1 / 衣康酸 / 自噬 / 预后