肺癌细胞外泌体微小RNA-1234-3p调控肿瘤相关巨噬细胞和T淋巴细胞功能促进免疫逃逸的机制研究

摘要

目的 探讨肺癌细胞外泌体微小RNA-1234-3p(miR-1234-3p)对肺癌细胞恶性行为、肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)极化、T细胞功能的影响及其潜在分子机制。方法 提取肺癌A549细胞外泌体，用透射电镜观察其形态；采用蛋白质印迹法(Western blot)检测外泌体标志蛋白[肿瘤易感基因101(TSG101)、CD63、CD9]表达；采用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测miR-1234-3p相对表达水平；通过转染抑制外泌体miR-1234-3p表达，采用CCK-8法、划痕实验和Transwell侵袭实验检测A549细胞的增殖、迁移和侵袭能力。将外泌体分别与巨噬细胞、T淋巴细胞共培养，采用Western blot检测TAMs极化标志物CD206、CD163表达；采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测细胞因子[白细胞介素(IL)-6、IL-10、转化生长因子-β(TGF-β)]分泌水平；通过细胞实验检测T淋巴细胞增殖、凋亡能力及功能分子[γ干扰素(IFN-γ)、程序性死亡受体1(PD-1)]表达；采用Western blot检测磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)信号通路相关蛋白表达水平。结果 分离的外泌体为圆形双层囊泡，直径50～200 nm,且表达TSG101、CD63、CD9蛋白。A549细胞中miR-1234-3p表达水平高于人正常肺上皮细胞BEAS-2B, A549细胞外泌体中miR-1234-3p表达水平高于亲本A549细胞，差异有统计学意义(P<0.001)。抑制外泌体miR-1234-3p后，A549细胞的增殖、迁移和侵袭能力降低，差异有统计学意义(P<0.001)。抑制外泌体miR-1234-3p后，巨噬细胞M2型极化标记蛋白CD206、CD163水平降低，细胞因子IL-10、TGF-β水平降低，IL-6水平升高，差异有统计学意义(P<0.001),表明巨噬细胞向M2型极化受到抑制。T淋巴细胞中，抑制外泌体miR-1234-3p后，细胞活力升高，细胞凋亡率降低，功能分子IFN-γ表达水平升高，PD-1表达水平降低，差异有统计学意义(P<0.01或P<0.001)。抑制外泌体miR-1234-3p后，A549细胞中磷酸化(p)-PI3K和p-AKT蛋白水平降低，差异有统计学意义(P<0.001)。结论 肺癌细胞外泌体miR-1234-3p可能通过激活PI3K/AKT信号通路，促进肺癌细胞恶性行为、TAMs向M2型极化及T淋巴细胞功能紊乱，从而调控免疫抑制微环境，促进肺癌进展。

关键词

肺癌 / 外泌体 / 微小RNA-1234-3p / 肿瘤相关巨噬细胞 / T淋巴细胞 / 免疫逃逸 / 免疫检查点 / 肿瘤微环境

基金资助

陕西省自然科学基础研究计划项目(2021JQ-403)