CircASAP1靶向miR-4500促进骨肉瘤细胞增殖并抑制凋亡的机制研究

摘要

目的 探讨环状RNA ASAP1（circASAP1）靶向微小RNA-4500（miR-4500）对骨肉瘤细胞增殖和凋亡的调控作用。方法 选取人成骨肉瘤细胞（Saos-2）作为实验对象，将其置于含有10%胎牛血清的DMEM培养基中培养，同时维持5%的CO₂。采用RT-qPCR检测circASAP1和miR-4500在骨肉瘤组织中的表达。分别转染si-NC（40 nmol/L）、si-circASAP1（40 nmol/L）、pcDNA（0.4μg）、pcDNA-circASAP1（0.4μg）、miR-NC（40 nmol/L）、miR-4500模拟物（40 nmol/L）、si-circASAP1+anti-miR-NC（40 nmol/L）、si-circASAP1+anti-miR-4500（40 nmol/L）至Saos-2细胞。采用CCK-8、集落形成实验、流式细胞术检测细胞增殖和凋亡。采用双荧光素酶报告实验分析circASAP1与miR-4500的相互作用。结果 相较于瘤旁组织，骨肉瘤组织中circASAP1表达升高，miR-4500表达降低，差异均有统计学意义（P<0.001）。与si-NC组比较，si-circASAP1组circASAP1表达、吸光度（OD）值、细胞克隆形成数降低，差异均有统计学意义（P<0.001）。与si-NC组比较，si-circASAP1组cleaved-caspase3蛋白水平、cleaved-caspase9蛋白水平、凋亡率上调，差异均有统计学意义（P<0.001）。StarBase搜索发现miR-4500与circASAP1存在特异性结合序列。miR-4500模拟物和WT-circASAP1共转染显著降低细胞的相对荧光素酶活性[（0.34±0.03）与（0.95±0.06）,t=27.280,P<0.001]。pcDNA-circASAP1组miR-4500表达低于pcDNA组，而si-circASAP1组miR-4500表达高于si-NC组，差异均有统计学意义（P<0.001）。与miR-NC组比较，miR-4500组miR-4500表达、cleaved-caspase3蛋白水平、cleaved-caspase9蛋白水平、凋亡率升高，而OD值、克隆形成数下降，差异均有统计学意义（P<0.001）。与si-circASAP1+anti-miR-NC组比较，si-circASAP1+anti-miR-4500组miR-4500表达、cleaved-caspase3蛋白水平、cleaved-caspase9蛋白水平、凋亡率下降，而OD值、克隆形成数上调，差异均有统计学意义（P<0.001）。结论 骨肉瘤组织中circASAP1表达增加，miR-4500表达降低，且circASAP1通过靶向miR-4500促进骨肉瘤细胞增殖并抑制凋亡。

关键词

骨肉瘤 / 环状RNA ASAP1 / 微小RNA-4500 / 增殖 / 凋亡 / 克隆形成数 / 集落形成实验 / 流式细胞术